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| 植物的微卫星标记及其应用 | ||||||||
| 作者：佚名 文章来源：本站原创 点击数： 更新时间：2004-4-21 | ||||||||
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植物的微卫星标记及其应用 刘树兵，王洪刚 (山东农业大学 农学院， 山东 泰安 271018) MICROSATELLITE MARKERS AND THEIR APPLICATIONS OF PLANT LIU Shubing，WANG Honggang (College of Agronomy,Shandong Agricultural University,Taian 271018，China) Key words： microsatellite;molecular markers 摘要：微卫星标记是继RFLP、RAPD等分子标记之后出现的又一种新型分子标记技术，近年来在植物的基因组研究中应用越来越多，本文综述微卫星标记的产生、类型及应用。 关键词：微卫星；分子标记 中图分类号:Q37 文献标识码:A 文章编号:1000-2324(2002)01-0112-05 1 基因组中的微卫星及其分布 生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列〔14〕，根据重复序列在基因组中的分布形式可将其分为串联重复序列和散布重复序列。其中，串联重复序列是由相关的重复单位首位相连、成串排列而成的。目前发现的串联重复序列主要有两类：一类是由功能基因组成的(如rRNA和组蛋白基因)；另一类是由无功能的序列组成的。根据重复序列的重复单位的长度，可将串联重复序列分为卫星DNA、微卫星DNA、小卫星DNA等〔3〕。微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中〔15，38〕。在植物中通过对拟南芥〔7〕、玉米〔35〕、水稻〔11〕、小麦〔28，32，33〕等的研究表明微卫星在植物中也很丰富，均匀分布于整个植物基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化是非常大的，如在主要的农作物中两种最普遍的二核苷酸重复单位(AC)n和(GA)n在水稻、小麦、玉米、烟草中的数量分布频率是不同的。在小麦中估计有3000个(AC)n序列重复和约6000个(GA)n序列重复，两个重复之间的距离平均分别为704kb、440kb〔32，33〕，而在水稻中，(AC)n序列重复约有1000个左右，(GA)n重复约有2000个，重复之间的平均距离分别为450kb、225kb〔41〕。另外在植物中也发现一些三核苷酸和四核苷酸的重复，其中最常见的是(AAG)n、(AAT)n〔15〕。在单子叶和双子叶植物中SSR数量和分布也有差异，平均分别为64.6kb和21.2kb中有一个SSR。研究还发现，单核苷酸及二核苷酸重复类型的SSR主要位于非编码区，而有部分三核苷酸类型位于编码区。另外在叶绿体基因组中，目前也报道了一些微卫星，以A/T序列重复为主〔3〕。 2 微卫星标记的类型 2.1 SSR标记(STMS) 研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展起了SSR标记。SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。 与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11，12，18，19，33〕、目标基因的标定〔8，9，21，22，26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中。但应看到，SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究，因而其开发费用相当高，各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。由于SSR标记具有较大的应用价值，且种属特异性较强，目前在一些主要的农作物中SSR标记研究都进行了合作，共同进行STMS引物的开发。 2.2 由微卫星衍生的微卫星标记 2.2.1 微卫星引物PCR(MP-PCR) 也叫单引物扩增RCP(single amplification PCR,简写为SPAR)该方法是利用单个微卫星的人工合成寡核苷酸片段为引物进行PCR扩增。可以想象，如果两个反向排列的微卫星出现于同一可扩增的范围内，这两个反向排列的微卫星间的序列就可扩增出来，因而该方法称为微卫星引物PCR〔24〕。用此方法扩增出来的是两个反向排列的微卫星之间的序列，并非微卫星位点本身。实践证明，用该方法对三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重复的微卫星位点的扩增效果较好，而对二核苷酸位点重复的扩增效果较差。甚至有人认为，与RAPD技术相比，该法并没有明显的优越之处。 2.2.2 ISSR(Intersimple sequence repeat) 这是Zietkiewitcz等(1994)发展起来的又一种微卫星基础上的分子标记〔44〕。与SSR标记相反，该法是直接利用同位素标记的SSR序列为引物，用PCR的方法扩增两个SSR之间的单拷贝序列。为增加特异性，设计引物时在引物的5′端和3′端分别引入1～2个选择性碱基，引物长度16～18bp，扩增产物通过放射自显影显现，这样其扩增物就是MP-PCR扩增产物中的一部分，提高了实验结果的可重复性。ISSR引物的开发不象SSR引物一样需测序获得SSR两测的单拷贝序列，开发费用降低。与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不象SSR标记一样具有较强的种特异性；与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方便，因而是一种非常有发展前途的分子标记，已用于遗传作图〔19〕、品种鉴定等研究。 2.3 微卫星与其它标记相结合产生的分子标记 2.3.1 与RFLP相结合产生的分子标记 SSR与RFLP相结合是最早发展起来的基于微卫星的分子标记，1996年，Ali等人首先在人类中进行了该方面研究〔4〕，他们将人的总基因组DNA酶切、电泳后，用同位素标记的人工合成的与微卫星序列互补的寡核苷酸探针进行分子杂交，在人类中揭示了多个微卫星位点的RFLP指纹。Weising等(1998)利用该法在多种植物中检测到了具有高水平多态性的目标区域〔39〕。可以看出，该法检测到的多态性实际上是由含有微卫星的酶切片段长度的变异造成的。 2.3.2 随机扩增微卫星多态性(Random amplified microsatellite polymorphism,RAMPs) 这是SSR与RAPD技术相结合产生的一种微卫星标记。其原理是利用一个5′端锚定的SSR引物和一个RAPD随机引物进行PCR扩增〔6〕，RAPD引物的结合位点是以微卫星为基础的扩增产物的终止位点，它所揭示的是出现于微卫星位点本身或两个引物之间的相关序列长度的多态性，扩增产物也不象ISSR一样仅限于基因组中一个特定的微卫星位点。 2.3.3 选择性扩增微卫星多态性位点(Selective amplification of microsatellite polymorphism loci,SAMPL) 这是SSR与AFLP相结合产生的一种分子标记，结合了二者的优点。该方法利用微卫星序列设计引物，不需要预先对微卫星位点进行克隆、测序等研究。在AFLP实验中，一般要进行几个主要的步骤，包括：(1)基因组DNA的双酶切；(2)酶切片段与接头连接；(3)预扩增(第一次扩增)；(4)扩增(第二次扩增)；(5)扩增产物的检测〔42〕。SAMPL的具体做法就是在AFLP反应的第二次扩增时将一个具有3个选择性碱基的AFLP引物与一个16～18bp的人工设计的SAMPL引物组合在一起，这个SAMPL引物通常都是位于复杂重复单位中的、连接在一起的两个不同序列的微卫星及介于其间的序列构成的。这样，在扩增时SAMPL引物的5′端重复提供进行严格复性的5′端锚定位点，因而该引物的3′端的第二个微卫星就可延伸〔16〕。由于不同的限制性内切酶、SSR引物及选择性接头引物的组合，SAMPL所揭示的多态性几乎是无限的。与其它方法相比，该法的实验步骤可能最复杂，但其结果可能是最有价值的。 3 微卫星标记的应用 3.1 遗传作图 SSR标记是微卫星标记中用于作图的最常用的分子标记。目前利用SSR标记已经绘制了包括人〔12〕、小鼠〔18〕等的遗传图谱。在植物中也进行了该方面研究，如Roder等绘制的小麦的SSR遗传图包含了279个微卫星位点〔33〕。其他类型的微卫星标记也已用于遗传作图，如在莴苣中已利用SAMPL标记作图〔40〕；在一粒小麦和大豆中利用ISSR标记绘制了遗传图〔19〕；在大麦中利用MP-PCR、RAMPS绘制了遗传图〔11〕，另外在水稻〔43〕和玉米〔46〕中也已绘制了微卫星图谱。 3.2 基因的标定与标记辅助育种 微卫星标记已广泛用于控制重要性状基因的标定及标记辅助育种研究，并取得了较大进展。在农作物中，已利用微卫星标记建立了与水稻抗白枯病基因、蜡质基因，大豆抗条纹花叶病、开花期基因等基因连锁的微卫星标记。标1列出了在小麦中已建立微卫星标记的基因。 表1 小麦中已建立微卫星标记的基因 Table 1 SSR markers constructed in wheat
3.3 品种指纹作图 SSR标记由于检测的点多，揭示的多态性高，在植物的指纹作图中具有非常重要的价值，Manifesto等对阿根廷的105份小麦品种用位于不同染色体上的探针检测后发现亲缘关系越近的品种，指纹谱的相关系数越高〔23〕。Lelley和Stachel对来自匈牙利、澳大利亚和德国3个不同生态区的小麦品种用42个位于小麦每个染色体臂的微卫星标记研究后发现这些微卫星标记能有效地区别这些生长于不同生态区的品种〔22〕。Weising等认为，对于品种鉴别来说，SSR标记要比RAPD、MP－PCR等分子标记优越得多，因为通过SSR位点产生的基因型是毫无疑义的，获得的资料可以在不同的实验室间获得重复并共享〔39〕。 3.4 遗传多样性分析 微卫星标记由于揭示的多态性水平高，非常适宜于进行遗传多样性分析。特别是建立在PCR基础上的微卫星标记比RFLP更易操作并适宜于自动化分析。许多研究发现利用很少的微卫星即可进行遗传多样性分析及系统进化研究。目前许多作物中都开展了该方面的研究。Pestson等利用18个微卫星标记对113份二倍体粗山羊草进行了分析，认为微卫星标记非常适宜于遗传多样性分析并对种质资源的收集非常有用〔27〕。Prasd等利用20个小麦微卫星标记估算了55个小麦基因型的遗传多样性〔30〕；另外在大麦〔36〕、油菜〔10〕中都已开展了该方面研究。 3.5 外源遗传物质的鉴定 微卫星标记在远缘杂交中外源遗传物质的鉴定方面应用也非常多。Peil用SSR标记鉴定了普通小麦种间的代换系〔25〕，Procunier鉴定了四倍体小麦的异附加系〔31〕。其他类型的微卫星标记也有许多成功的报道，如Salimath利用ISSR标记分析了糁子基因组的起源〔34〕。估计微卫星标记在该方面的应用会越来越广泛，但应注意，有些微卫星虽然是位点特异性的，但并不具备相应的部分同源性，与RFLP相比，所揭示的部分同源性是非常低的，因而在染色体的部分同源性鉴定及比较作图中，其应用受到限制〔5〕。 参考文献： 〔1〕马渐新，周荣华，董玉琛等.来自长穗偃麦草的抗小麦条锈病基因的定位〔J〕.科学通报，1999，44(1)：65-69. 〔2〕万平，刘大钧.SSR标记与植物遗传育种研究.安徽农业大学学报〔J〕.1998，25(1)：92-95. 〔3〕孙乃恩，孙东旭，朱德熙编著.分子遗传学.南京大学出版社〔M〕.1996，41-42. 〔4〕Ail S,Muller S R,Epplen R W.DNA fringerprinting by oligonucleotide probes specific for simple sequece repeat 〔J〕.Human Genet,1986,74:239-243. 〔5〕Anderson J A,Ogihara,Srrells M E,et al.Development of a chromosomal arm map for wheat based on RFLP markers〔J〕.Theor.Appl.Genet,1992,83:1035-1043. 〔6〕Becker J,Heun M..Barley microsatellites:allele variation and mapping.〔J〕.Plant Molecular Biology,1995,27:835-845. 〔7〕Bell CJ.Assement of 30 microsatellite loci to the linkage mapping of Arabidopsis〔J〕.Genomics,1994,250:39-49. 〔8〕Borner A,Roder M S,Unger O,et al.The detection and molecular mapping of a major gene for nonspecific adult-plant disease resistance against stripe rust (Puccinia striiformis) in wheat〔J〕.Theor Appl.Genet,2000,100:1217-1224. 〔9〕Chantret N,Sourdille P,Roder M,et al.Location and mapping of the powdery mildew resistance gene MIRE and derecrion of a resistance QTL by bulked segregant analysis (BSA) with microsatellites in wheat〔J〕.Theor.Appl.Genet.2000,100:1095-1099. 〔10〕Chart Y M,Robertson A,Wilinkson MJ,et al..PCR analysis of oilseed rape cultivar using 5 anchored simple sequence repeat primers〔J〕. 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