李勇慧 曹晓燕

秦艽是我国重要的传统中药,主治寒热邪气、寒湿风痹、肢节痛、下水、利小便。能疗风、无问久新、通身挛急^[1,2],在祖国医学中是治疗风湿痹痛、关节病必不可少的药物。<中国药典>2005年版^[3]收载有龙胆科秦艽(大叶秦艽,又称大叶龙胆)（Gentiana macrophylla Pall）.、麻花秦艽G.straminea Maxim.、粗茎秦艽(又称粗茎龙胆)G.crassicaulis Duthie ex Burk.或小叶秦艽G.dahurica Fisch.等4种。处于黄土高原腹地的陕西和甘肃两省是其地道产区^[4]。陕、甘两省的主流秦艽商品为大叶秦艽Gentiana macrophylla Pall的根。

目前,国内企业以秦艽为原料的制剂较多,按照国家药典会关于中药指纹图谱研究的技术要求和补充规定,我们以梯度洗脱法对秦艽药材指纹图谱进行研究,试验证明, 本文采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，可操作性强,重现性好,可作为秦艽药材的指纹图谱研究的基础^{[5，6，7，8]}。

     龙胆苦苷（gentiopicrin）

图 1.  秦艽中主要成分的分子结构

Fig. 1  Molecular structures of the main components of Gentiana macrophylla Pall

1  仪器与材料

1.1  实验仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪（包括自动进样器，DAD检测器，AGILENT公司）；SHIMADZU LC-2010高效液相色谱仪（包括自动进样器，紫外检测器，日本SHIMADZU公司）； MILLI-Q超纯水仪(MILLIPORE公司)； RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）等。

1.2  试剂

甲醇（天津市科密欧化学试剂开发中心，色谱纯）；磷酸（天津市化学试剂三厂，分析纯）；所用水为超纯水。

1.3  标准品、药材

标准品：龙胆苦苷（gentiopicrin，110770-200409），均购自中国药品生物制品检定所。

药材：秦艽药材分别从陕西、甘肃等地采集或收集，经陕西师范大学生命科学学院植物分类教研室鉴定为龙胆科科植物秦艽(Gentiana macrophylla Pall)的干燥根，所测样品详见表1。

Tab 1  The samples of fingerprints of Gentiana macrophylla Pall

2  实验方法

2.1  色谱条件 

色谱柱：Shimadzu C18 (150 mm×4.6 mm) ；

流动相：甲醇－0.4％磷酸水溶液，低压梯度洗脱模式见表2；

柱温：25 ℃；流速:1.0 mL/min；检测波长:230 nm；进样量：10μL；

表2  指纹图谱流动相线性梯度表

Tab 2  The linearity of mobile system of fingerprints

2.2  对照品溶液制备

精密称取龙胆苦苷标准品5mg，置10 mL容量瓶中，加色谱纯甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得对照品溶液。

图 2  标准品的HPLC色谱图

Fig 2  HPLC chromatogram of reference substances

2.3  秦艽样品溶液制备

精密称取37 ℃干燥至恒重的秦艽样品2.0g（过40目筛），置50 mL具塞锥形瓶中，准确加入甲醇10 mL，称定重量，超声提取40min，用甲醇补足重量，摇匀，1000 rpm离心2 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得秦艽试品溶液。（图3）

图3  秦艽样品HPLC色谱图

图 3  秦艽样品HPLC色谱图

Fig 3  HPLC chromatogram of sample of Gentiana macrophylla Pall

2.4  指纹图谱评价方法

采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版（2004A）。该软件具有生成对照图谱的功能，相似度计算方法为夹角余弦法，可支持多点校正。

2.5 方法学考察

2.5.1  稳定性试验  取同一批供试品溶液，分别于0 h，12 h，24 h，36 h，48h检测指纹图谱，各特征峰表观丰度无明显差异。比较色谱峰保留时间，各色谱峰共有峰保留时间RSD在0.09%~0.34%之间，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行计算，结果相似度均大于0.995，表明样品溶液在48 h内稳定。

2.5.2  精密度试验  取同一供试品溶液，连续进样5次，检测指纹图谱。比较各色谱峰的保留时间，结果表明5次进样各共有峰保留时间RSD在0.05%~2.96%之间，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行计算，结果相似度均大于0.991，表明供试品进样精密度良好。

2.5.3  重复性试验  取同一批秦艽药材5份，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别检测指纹图谱，并考察各特征峰的表观丰度，结果表明各共有峰保留时间RSD在0.05%~2.48%之间，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行计算，结果相似度均大于0.996，表明本法测定的重复性良好。

3.1  样品测定

3.1.1  图谱测定时间的确定  取样品溶液5μL，注入高效液相色谱仪，记录100 min内色谱图，结果表明75min后无有意义峰出现，故确定图谱记录时间为75 min。

3.1.2  空白试验  取色谱纯甲醇溶液5 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果表明空白无干扰。

3.1.3  样品指纹图谱测定  取秦艽样品按2.3项下方法获得供试溶液，进样10μL，记录HPLC色谱图。结果见图。

3.2  指纹图谱建立与分析

3.2.1  共有峰的确定  对多批样品进行测定，记录75 min色谱图，并对不同供试品所得指纹图谱进行分析，选择稳定性较好，吸收强，特征明显的色谱峰为共有峰共标定了8个峰。3号峰和5号峰为主要特征峰，并选择这两个峰为marker峰，进行谱峰校对。各特征峰峰号及保留时间见表3，代表性指纹图谱见图3。

表 3  特征峰峰号及保留时间

Tab 3  Peak No. for characteristic peaks and retention time

3.2.2相似度计算  指纹图谱相似度评价采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版（2004A）进行计算。首先将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，选定上述四个特征峰为marker峰，进行谱峰匹配，通过中位数矢量计算得出西洋参样品指纹图谱的共有模式，并以此共有模式为标准，采用夹角余弦算法对各批样品进行整体相似度评价，结果见表4，图4。

表 4 不同批次秦艽样品相似度比较

Table 4  Comparison of similarity of fingerprints among different samples from Liuba County

图 4  25批秦艽样品HPLC指纹图谱

Fig 4  HPLC fingerprints of 25 batches of samples of Gentiana macrophylla Pall

注：S1~ S25分别代表表1中1~25号样品。

Notes: S1~ S25 represents the sample of 1~25 respectively in Table 1.

3.2.3  样品指纹图谱分析  测试样品包括了不同产地、不同类型（栽培、野生），其HPLC指纹图谱均具有上述特征峰，相互间吻合较好，可作为秦艽的特征指纹。但因样品的个体差异，特征峰的相对含量分布差异较大。在所建立的色谱条件下，各特征峰均达到基线分离，因此该差异可通过各特征峰的表观丰度（以纵坐标刻度测量）进行表达。将样品色谱图与标准品色谱图的保留时间进行比对，可以确定龙胆苦苷，中国药典2005版以龙胆苦苷作为秦艽药材质量控制标准^[3]，因此，确定以8个特征峰为秦艽HPLC特征指纹图谱是合理的。

4  讨论

4.1  提取方法的选择

    实验以尽可能多体现秦艽中主要成分为原则，设计样品溶液制备方法。分别选取70％乙醇、70％甲醇、甲醇、氯仿为提取溶媒，并对提取物HPLC图谱分析，发现用甲醇法制备的供试液指纹图谱响应峰最多，且样品各峰分离良好。并比较了超声提取法、热回流提取及索式提取法，发现超声提取法所得样品HPLC指纹图谱各峰响应值较高。因此，本文选择超声提取法，用甲醇处理得到供试品样品。

4.2   流动相的选择

实验过程中选用了多种流动相：（1）甲醇－0.4％磷酸不同梯度洗脱；（2）甲醇－乙腈－0.4％磷酸不同梯度洗脱；（3）乙腈－0.4％磷酸不同梯度洗脱。以甲醇－0.4%磷酸线性梯度洗脱为最佳，HPLC图谱上在230nm的各色谱峰分离度较好，色谱峰的形状也好。因而选用甲醇－0.4％磷酸线性梯度作为秦艽药材的HPLC指纹图谱的流动相。

4.3  检测波长及柱温的选择

在前述色谱条件下进样测定，从200 nm~ 400 nm波长范围内，挑选了210 nm，245 nm，275 nm，280 nm，290 nm，320 nm，340 nm波长显示色谱图，210nm下色谱图与230nm基本一致，以230nm较好，250nm、270nm、290nm色谱峰的峰数目较少，而320nm、340nm色谱图的基线不平，因而未选这些波长为测定波长，选择230nm为指纹图谱检测波长。试验比较了25℃、30℃、35℃、40℃四个不同柱温，发现随柱温上升各色谱峰保留时间略有提前，本文选择出峰时间适中的25℃为指纹图谱检测柱温。

4.4  指纹图谱相似度评价

本实验采用了HPLC对秦艽进行分析，各样品HPLC指纹图谱虽存在一定差异，但其均具有相同的色谱特征峰。该法一次进样即能得到众多的色谱峰，分离分析效率高，且各色谱峰保留时间相当稳定，所建立的指纹图谱具有稳定性和可控性。

从陕西及甘肃不同产区25批秦艽药材指纹图谱的分析结果可以看出，各色谱峰的保留时间匹配较好，保留时间RSD均小于3%。但因样品的个体差异，特征峰的相对含量分布差异较大，该差异可通过各特征峰的表观丰度表达。由表3可见，秦艽药材的相似度均大于0.98，平均为0.996，表明陕西秦艽药材质量比较稳定，均可作为投料使用。

本文实验结果进一步证实了色谱指纹图谱具有“整体性”和“模糊性”的基本属性评价色谱指纹图谱的结果，是根据色谱指纹图谱的模糊属性，但又要求指纹图谱具有“指纹”特征，即要求专属、稳定和实用。对于色谱指纹图谱中的各色谱峰，并不要求对每个组分的化学结构都清楚，也不需要对呈现在图谱中的每个组分都清楚地定量，只需不同批次的同一种药品的指纹图谱保持基本一致。中药指纹图谱反映了该中药的化学组成及其含量分布状况，可实现对中药的多组分和多指标分析。对鉴别药材的真伪优劣及其稳定性均具有非常重要的参考价值。

参考文献：

 [1] Editorial Board Of China Herbal, State Administration of Traditional Chinese Medicine,

China. China Herbal（中华本草） [M]. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers,

1999.

[2] Zheng H Z, Dong Z H, She J. Modern Research and Applications of Traditional Chinese 

Medicine (中药现代研究与应用) [M]. Beijing: Xue yuan Press, 2001.

[3] Ch P (中国药典) [S]. 2005 ed .Vol 1

[4] Quan Y S. Herbal study on Qin jiao [J]. Northwest PharmJ (西北药学杂志),

1997, 12(3): 113-115.

[5] 刘丽莎,张西玲,黄晓萍.栽培和野生秦艽及麻花秦艽中龙胆苦苷的含量测定[J].中国中药杂志,2002,27(2):152.

[6] 张雪荣.秦艽及其伪品的比较鉴别[J].中草药,2000,31(8)632.

[7] 孙文基,沈晓红,高海,等.秦艽药材中龙胆苦苷的含量测定[J].西北药学杂志,1998;13(1):43.

[8] 熊英,马逾英.一种伪品秦艽的鉴别[J].成都中医药大学学报,2002,25(3):49.