TTC－脱氢酶活性测定方法的改进

秦冰 陈东辉 陈亮陈丽 (东华大学环境工程学院，上海  200051)

    摘要  以活性污泥为对象，对影响脱氢酶的测定因素(样品预处理、培养温度、还原剂、终止剂、萃取剂等)做了进一步研究，解决2,3,5－三苯基氯化四氮唑(TTC)法测定污泥脱氢酶活性中标准曲线制作繁琐和稳定性差等方面的问题，并确定了TTC－脱氢酶活性测定的最佳条件。该方法与原有方法相比，测定结果可靠、重现性好、准确度高，对水质处理生物技术领域具有非常重要的意义。

关键词： 脱氢酶  脱氢酶活性  活性污泥

1前言

目前，国内污水厂普遍应用的控制活性污泥性能的参数主要有菌群总数、污泥容积指数(SVI)、污泥浓度(MLSS)、挥发性悬浮固体(MLVSS)等，但它们均不能直接定量地反映污泥活性。因为菌胶团形成以后不易记数，显微镜也难以准确地观察出微生物的数量及活性状况；SVI只反映污泥的松散程度和凝聚沉降性能；MLSS既包括活的、死的微生物，也包括没有分解的有机物和无机物，反映不出活的微生物的具体数量及污泥活性的变化情况；MLVSS既没有区分开活的和死的微生物细胞，也没有区分开生物量和惰性挥发性固体。

废水生物处理的实质，是经微生物所产生的多种酶催化的生物氧化还原反应。在有机物的氧化过程中，脱氢酶是作用在代谢物上的第1个酶，是微生物降解有机污染物获得能量的必须酶，能够激活某些特殊的氢原子，使这些氢原子可以被适当的受氢体移去从而将原来的物质氧化，它参与从有机物到分子氧化的电子得失的整个过程，由活的生物体所产生。因此，脱氢酶活性在很大程度上反映了生物体的活性，而且能直接表示生物细胞对其基质降解能力的强弱，因而成为废水生物处理中一项考察污泥活性的重要指标。  

脱氢酶活性可以通过加入人工受氢体的办法进行检测。通常用于检测脱氢酶活性的人工受氢体包括TTC、刃天青、亚甲基蓝以及对碘硝基四唑紫(INT)等^[1]，其中研究和应用最多的是TTC试验^[2～9]。但是在以往的文献中，此法一直存在着3个主要的缺点，即标准曲线制作烦琐和稳定性差；萃取剂的不理想；以及TTC试验中高温(90℃)萃取严重影响分析结果的准确度，致使该项生化分析技术的推广应用受到限制。本文采用低亚硫酸钠作为TTC还原剂，以甲苯为萃取剂，并对测定中的诸多影响因素也做了研究，克服了上述缺点，从而为TTC一脱氢酶活性测定方法的推广奠定基础。

2实验方法

实验中选用无色的TTC做为人为受氢体，受氢后生成深浅不同的红色三苯基甲膳(TF)，采用甲苯在常温下萃取。由于TF溶液在波长486nm附近有吸收峰，因而可采用分光光度法于该波长处测定其吸光度，进而根据标准曲线计算出TF生成量，此值即为TTC—脱氢酶活性(简称为TTC—DHA)。

2.1实验装置

本实验采用间歇式SBR法，间歇式活性污泥处理装置的运行条件为：

活性污泥取自上海市天山水质净化厂二沉池回流污泥，并经过2周的驯化；

采用人工配水，进水COD浓度为800mg／L；

水温为15～20℃；

pH值为6.5～8.0；曝气池DO为2～4mg／L。

2.2实验仪器与试剂

2,3,5－三苯基氯化四氮唑(TTC)、三(羟甲基)胺基甲烷(Tris)、盐酸、低亚硫酸钠、三氯甲烷、丙酮、乙醇、甲苯，均为分析纯试剂。

SPX－80B生化培养箱，上海跃进医疗器械厂；

800型离心沉淀器，上海手术器械厂；

752紫外光栅分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

2.3主要试剂的配制方法

0.4％TTC溶液：取0.4gTTC溶于少量蒸馏水中，再稀释至0.1L，贮存于棕色瓶中，1周更换1次。

Tris-HCl缓冲液(pH＝8.4)：称取6.037g Tris，加入20mL 1mol/L HCl，再定容至1L。

TTC标准溶液：称取50mgTTC定溶于50mL茶色容量瓶中，此溶液即为l mg/mL TTC的标准溶液，棕色试剂瓶保存。

TTC系列溶液：分别吸取1、2、3、4、5、6、7mL lmg／mL TTC标准溶液，定容至50mL，即配成浓度分别为20、40、60、80、100、120、140ug/mL TTC系列溶液。

2.4标准曲线的制作

在8支20mL具塞试管中，依次加入2mL Tris-HCl缓冲液、2mL 蒸馏水和2mL TTC系列溶液，对照管不加TTC；再各加入1g低亚硫酸钠，振荡摇匀，待溶液充分显色后，各管分别加入5mL甲苯，振荡萃取3min，取上层有机溶液在752紫外光栅分光光度计上486nm处测定吸光度值。绘制标准曲线如图1。

对该组数据线性回规，得到标准曲线方程为：Y＝0.0083X－0.0156，相关系数为0.9952。

2.5活性污泥脱氢酶的测定

取10mL活性污泥于具塞离心管中，4000 r/min离心5min后弃去上清液，再加入蒸馏水至10mL并搅拌均匀，离心5min后弃去上清液。这样反复用蒸馏水洗涤离心处理3次，最后向离心管中加入蒸馏水至10mL并搅拌均匀。准备若干支试管,分3组做平行样。逐支向试管中加入2mL Tris-HCl缓冲溶液，0.5mL TTC溶液(4mg/mL)，2mL上述待测污泥混合液和0.5mL上清液。将各试管摇匀后立即放入（37士1）℃恒温箱中培养2h。取出后迅速滴入2滴浓硫酸，摇匀以中止反应。然后向各试管中加入5mL甲苯，常温下振荡萃取。放置片刻，待溶液分层后，在4000r/min下离心5min，取上层有机溶剂于486nm处测定吸光度值。在上述条件下，吸光度值的大小表示了活性污泥脱氢酶活性的高低，lh产生1ug TF的量为一个酶活力单位。即把测量得到的吸光度值通过标准曲线换算成TTC浓度，再除以反应时间(2h)和污泥浓度(MLSS)就得到污泥的脱氢酶活性。

3结果与讨论

3.1样品前处理对脱氢酶活性测定的影响

在活性污泥脱氢酶活性测定方面,一般用0.85％的生理盐水洗涤样品，本文采用蒸馏水和0.85%的氯化钠(NaCl)溶液分别洗涤同一污泥，进行对比分析，结果发现，蒸馏水洗涤的测定效果优于0.85％NaCl溶液，见表1。

表1  洗涤方法对脱氢酶活性测定的影响

测定次数	蒸馏水	0.85% NaCl
1	0.759	0.633
2	0.772	0.0510
3	0.672	0.430

由表l可见，用0.85%NaCl溶液洗涤所测得的吸光度值低于用蒸馏水洗涤，这可能与0.85%NaCl溶液中大量Cl^—不利于氯化有机物TTC发生解离有关。用蒸馏水洗涤样品，就可避免这一问题，提高TF检出量。

3.2培养温度

TTC试验中，一般采取高温条件下萃取TF。这是因为高温条件可以破坏细胞结构，改进细胞的透性，以利于萃取剂对TF结晶发生溶解作用。也就是说，高温条件实际上就是为了弥补萃取剂浓度不适，提高TF萃取能力不足而采取的强化措施。然而，常用的萃取剂(如甲醇、丁醇、丙酮等)沸点较低，萃取时易蒸发甚至破塞而溢，因此在实际应用中受到限制。我们通过选择最佳萃取剂及其最适浓度，实现了常温萃取。我们将终止酶反应后的样品培养液进行离心，弃去上清液，然后用甲苯于常温条件下萃取TF，考虑到废水生物处理过程中微生物对环境温度的适应特点，将样品培养温度控制在（37土1）℃为宜。

为了验证37℃常温萃取TF的可行性，在2种温度条件下进行了萃取TF的对比实验，测定结果见表2。

表2   不同培养温度条件下测得的脱氢酶活性

测定次数	（37土1）℃	（90土1）℃
1	0.759	0.619
2	0.745	0.639
3	0.734	0.646

从表2可见，37℃萃取TF的效果优于高温萃取，测定的平均值为后者的1.175倍，说明影响萃取TF效果的主要因素是温度作用，但只要选择合适的有机溶液萃取其沉淀物，即使是在常温条件下进行，也可获得较为理想的测定结果。

在TTC试验中，以常温(37℃)萃取TF代替高温萃取，是脱氢酶活性测定研究中的一项重大改进，这不但有利于提高脱氢酶活性检测分析方法的可靠性，而且必将会对脱氢酶活性测定这一生化分析技术的广泛应用起到积极的推动作用。

此外，在37土1℃条件下反应的2h内应把离心管倾斜放置，不断混匀。为提高萃取率，把离心管倾斜放置，使试剂和微生物充分接触，否则TF生成量会受到影响。

3.3  TTC还原剂的选择

以往文献中制作标准曲线时通常以亚硫酸钠作还原剂，以氯化钴为催化剂，将标准TTC还原为TF。但此法的缺点在于不易显色。我们在2mL Tris—HCl缓冲液中加入1mL 60ug／mL TTC工作液，随后加入0.1g低亚硫酸钠，溶液立即呈现红色，显色稳定，不褪色。

3.4酶反应终止剂的选择

本实验中采用浓硫酸终止酶反应，可避免乙醇和丁醇受热易蒸发的问题，反应后向样品中加2滴浓硫酸，便可立即停止酶反应，同时使污泥变得完全无色。

3.5萃取剂的选择

脱氢酶与TTC反应生成TF，TF颜色深说明脱氢酶活性高，因而产物TF的萃取也是重要的一步。国外研究者曾采用过的萃取剂有甲醇、乙醇、丙醇，传统方法多用丙酮作为TF的萃取剂。

实验中对丙酮、乙醇、甲苯和三氯甲烷4种萃取剂进行了比较。结果表明，在同等条件下，丙酮萃取后溶液浑浊，乙醇萃取后溶液不分层。在同等条件下，甲苯和三氯甲烷作为萃取剂，液—液分层好，显色稳定，并且吸光度(A)值最大。但三氯甲烷比重比水大，离心后，其位置介于污泥与水层之间，操作起来不便。而甲苯比重较小，操作起来较三氯甲烷方便，因此，本实验选用甲苯为萃取剂。

4结论

本实验为活性污泥脱氢酶活性的快速测定提供了一个新的方法。该方法与原有方法相比，测定结果可靠、重现性好、准确度高，适用于污泥消化以及水质处理生物技术领域，可及时反馈信息，了解微生物群体的生物活性，对提高生化处理构筑物的功效和处理能力有非常重要的意义。

4.1样品前处理是消化污泥脱氢酶活性测定的必需步骤。用蒸馏水代替0.85%NaCl溶液洗涤污泥，可提高TF检出量。

4.2对终止酶反应后的样品培养液进行固液分离，弃去上清液，再用甲苯于常温(37℃)条件下萃取TF是可行的。萃取时间以3min最适宜。

4.3以低亚硫酸钠代替亚硫酸钠和氯化钴作还原剂，易显色且显色稳定。采用浓硫酸作反应终止剂，可避免乙醇和丁醇受热易蒸发的问题，效果好。

4.4采用甲苯代替丙酮在常温下进行萃取，液—液分层好，显色稳定，并且吸光度值最大，是本实验条件下的一种比较理想的萃取剂。

5参考文献

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2牛志卿. TTC－脱氢酶活性测定法的改进. 微生物学通报, 1994, 21(1): 59～61.

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