李勇慧 李向民

盾叶薯蓣( Dioscorea zingiberensis C. H. Wright)，俗称黄姜或火头根，为薯蓣科单子叶植物, 系我国特有的、狭域分布的薯蓣物种之一（郑晓琴等 2003），其薯蓣根茎中的皂苷元(diosgenin)含量高于薯蓣科其它种植物，是提取甾体类激素的重要药源植物（杭悦宇等 2004；刘艳丽等 2004）。皂素是生产雌激素和雄激素类药物的中间体，生产的药物广泛应用于抗炎、镇痛、麻醉、避孕、杀虫、治疗心脑血管疾病，现又应用于美容、保健等方面，被称为药用黄金（石炳谦和李梦春 2004）。 盾叶薯蓣作为我国的一个特有种，其分布范围为东经104°53′～112°50′，北纬23°42′～34°10′, 即秦岭以南, 南岭以北的米仓山、大巴山、武陵山、雪峰山和衡山等山区以及长江中上游及其支流的低中丘陵地区, 垂直分布在海拔100～1 500m 的河谷、山地, 落叶阔叶与常绿落叶阔叶混交林的边缘或稀疏的常绿灌木林内（丁志遵等 1983）。特殊的分布范围和生长环境使得这种植物在自然界中处在一种弱势状态, 其资源量恢复非常缓慢（丁志遵等 1983），而且随着人们对资源的掠夺和对生境的破坏, 生境也逐渐片断化, 物种基因库迅速萎缩, 造成遗传多样性下降。野生盾叶薯蓣居群数目和居群规模在不断变小，对该种居群遗传结构和变异水平的研究有助于有效地保护和利用这种重要的中药资源和探索盾叶薯蓣的遗传特性及其生存环境与薯蓣皂苷元含量的关系（杭悦宇等 2003）。

本文用扩增片段的长度多态性（AFLP）标记对我国盾叶薯蓣分布区的5个居群的遗传多样性进行检测, 分析不同来源盾叶薯蓣的遗传多样性和遗传结构，进行种内居群间亲缘关系分析，旨在为盾叶薯蓣的合理利用、杂交育种和保护生物学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

陕西杨凌薯蓣资源圃收集了来自陕西岚皋，重庆城口等地的六个居群的野生薯蓣居群材料（表1）。2006年7月1日取样，每株取第二片叶片的叶尖处，所采5株叶片混合3-5g，共30个样品。样品放在冰盒中带回实验室，存放在-78℃冰柜中，DNA的提取采用CTAB法。采用北京鼎国生物技术有限公司FISH-AFLP试剂盒。

表1 供试薯蓣品种材料

Tab.1 Materials used in the experiment

1.2  DNA 提取

按王关林和方宏筠（1998）中的CTAB方法，并加以改进。称取材料0.1g，液氮研磨三至四次；将粉末放到装有800ul提取缓冲液的2ml离心管中；加入60ul巯基乙醇混匀，60度预热30min，其间混匀二至三次取出样品于室温放置；待样品冷却到定温加入800ul氯仿：异戊醇（24：1），振荡混匀，15040×g离心15min；取上清到一新2mlEp管中加入1.5倍体积1*CTAB；放置20—30min，15040×g离心15min，将沉淀晾干溶于200uLTE-buffer（溶解）；加入400ul95%乙醇，20uLNaAC，-20度沉淀1h，15040×g离心15min；500uL75%乙醇洗，15040×g离心10min，加入30-50ulTE-buff，琼脂糖电泳检测，然后置于- 20 ℃ 贮存备用。

1.3  模板DNA的限制性酶切与连接

在0.5mL离心管中加入(20μL体系)：4μLDNA模板；1μL Adapter；2μL EcoRI（20,000U/mL）/MseI（10,000U/ml）；2.5μL 10X Reaction buffer；2.5μL 10mmol/L ATP；1μL T4 Ligase；7μLAFLP-Water；混匀离心数秒，37℃保温5h，8℃保温4h，4℃过夜。

1.4 AFLP预扩增

按照AFLP试剂盒说明，使用含一个碱基的预扩增引物，引物序列见表2。向0.2mL离心管中加入(25μL体系)：2μL模板DNA；1μL Pre-ampmix；2.5μL 10XPCR buffer；0.5μL Taq DNA polymease；18μL AFLP-Water。按下列参数PCR循环。预变性的温度和处理时间为94℃2min；按下列参数扩增30轮，94℃30s，56℃30s，72℃80s，在72℃下延伸处理5min。

表2 DNA接头和AFLP引物序列

Tab.2 DNA adapter and AFLP primer sequences

1.5 选择性扩增

用AFLP-TE将预扩增产物按1：20稀释，作为选扩模板。选扩引物使用3+3引物组合，即EcoRI和MseI选择性扩增引物均含3个选择性碱基，引物序列见表2。在0.2mL离心管中加入(25μL体系)：2μL预扩增稀释样品；10XPCR 缓冲液2.5μL；dNTP 0.5μL；EcoRI 引物和 MseI 引物引物各1μL；Taq DNA polymease 0.5μL；AFLP-Water17.5μL。按下列参数PCR循环(采用梯度PCR法)。预变性94℃2min；第一轮扩增参数：94℃30s，65℃30s，72℃80s；以后每轮循环退火温度递降0.7℃，扩增12轮；接着按下列参数扩增23轮：94℃30s，55℃30s，72℃80s；延伸加时72℃5min。将1μL PCR产物、1μL内标、1μL变性液混合后，95℃ 2min，冰浴，准备上样。

1.6 凝胶电泳分析

用ABI373测序仪进行AFLP多态性分析，用注射器吹打加样孔，预电泳3min后点击Pause键暂停测序仪，设置后开始电泳。电泳时间4h。用GENESCAN3.1软件分析胶图，片段大小，根据内标软件识别。用NTSYSpc-2.11F和POPGENE1.31软件包进行结果分析。

1.7 数据处理与分析

结果记录的标准是在同一迁移率上，有带记为“1”，无带记为“0”, 转换成01距阵，遗传相似系数(Genetic similarity，Gs)按公式Gs=2N_ij(N_i+N_j)计算（Nei和Li 1979)，式中N_ij表示在i和j材料中共有的带，N_i、N_j分别是材料i、j的带的数量，选用DICE相似系数（DICE 1945）。数据统计利用NTSYS-pc2.11F版（ROHLLF 1998）软件分析，用 SHAN程序中的 UPGMA方法进行聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类图。同时运用POPGENE1.32软件计算5个居群总遗传多样性(Ht)、居群内遗传多样性(Hs)、遗传分化系数Gst、基因流Nm、Nei遗传多样性指标(h)、Shannon信息指数(I)、遗传距离。将5个薯蓣居群进行UPGMA聚类。

2 结果

2.1 模板DNA

用改进的CTAB法提取植物基因组DNA，速度高，条带清晰，无污染，无RNA污染，纯度较高能满足AFLP分析的要求，结果如图1。

图1   盾叶薯蓣基因组DNA

Fig.1 The genome DNA of Dioscorea zingiberensis

2.2 引物

取盾叶薯蓣基因组DNA，利用EcoRI/MseI双酶切筛选引物，结果条带清晰，片段大小在35～1750bp，符合AFLP分析对酶切片段大小的要求，数量合适，分布均匀，证明该组引物适于盾叶薯蓣基的AFLP分析，见图2。

                                  图2  引物筛选

                               Fig.2 Primers filtrating

2.3 AFLP的多态性

在64对E+3/M+3的选择性扩增引物中筛选出9对AFLP选择性扩增引物。采用9对AFLP引物组合扩增出共得到14698条扩增带，其中多态性条带12628条，平均每对引物得到230条多态性条带，多态性比率85.92%。多态率最高的组合为E-ACT/M-CTC (94.46%)，最低的为E-AGG/M-CTA (74.75%)。相似系数范围0.548～0.778。结果说明AFLP能检测到很丰富的多态性。所用引物组合及统计结果见表3。

                          表3 9对AFLP引物选择性扩增结果

Tab.2 The results of nine pairs AFLP primers selected amplifying

2.3 单个样品聚类

使用NTSYS-pc2.11F分析软件对所获数据进行分析，利用UPGMA方法进行聚类分析，得到AFLP指纹图谱的分析树状图(图3)。绘制的聚类图表明不同样品薯蓣之间遗传距离为0.222～0.452。从图可见，薯蓣居群依相似系数0.70的水平可以将所研究的30个薯蓣个体分成5组。第一组包括样品3，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，27，28。其中除了3，10，11属于岚皋居群；24，27，28属于湖北居群外，均属于陕西白河县居群；第二组包括1，2，4，5，6，7，8，9均属于陕西岚皋居群；第三组包括25，26属于湖北居群；第四组有样品29属于重庆城口县居群；第五组有样品30属于甘肃庆城县居群的穿地龙。

                         图3 AFLP分析的30份薯蓣样品的聚类图

Fig.3 The dendrogram generated by AFLP data using UPGMA

Method among 30 Dioscorea zingiberensis cultivars

2.4 居群聚类

运用Popgene1.32软件计算得出30个薯蓣品种总的遗传多样性h=0.2322，Shannon信息指数I=0.3656，结果表明薯蓣各居群的遗传多样性较为丰富。用Popgene1.32在假设遗传平衡条件下对所有的5个居群进行分析, 计算出总的遗传多样性Ht=0.2331、群体间遗传多样性（Dst）为0.1123、居群内遗传多样性Hs=0.1208，群体内的遗传多样性占51.82％，群体间的遗传多样性占48.18％，群体内的遗传多样性大于群体间的多样性。

Nei基因分化系数（Gst）是衡量种群遗传分化最常用的指标，表示在总的遗传变异中种群间变异所占的比例（葛颂等 1999），用来表征亚群体间基因分化相对量的大小，其值越高表明亚群体间遗传分化程度越高；反之，越低（顾万春 2004）。遗传分化系数为0.4827表明盾叶薯蓣群体间存在一定的遗传分化。基因流（Nm）表明基因在群体间的交换程度，盾叶薯蓣的基因流为0.5418。Wright（1951）认为，当Nm>1时，说明居群间存在一定的基因流动。Nm=0.5418表明盾叶薯蓣居群间基因交流处于低等水平，交流比较少。

遗传一致度和遗传距离分别是从相同和相反方面度量群体间遗传关系的指标，遗传距离反映居群亲缘关系的远近。从表4中可以看出，岚皋种群和白河种群之间的遗传距离最小(为0.0343)，与湖北之间的遗传距离次之(为0.0458)，与重庆遗传距离较大(为0.1787)，而与甘肃距离最远（为0.2024）。说明岚皋种群、白河种群和湖北种群的遗传相似性更加一致。

表4 各居群间的遗传一致度和遗传距离

Tab.4 The genetic identity and genetic distance within population

根据薯蓣居群的遗传一致度，用POPGENE1.32软件进行UPGMA聚类分析，其结果如图4所示。其中岚皋和白河种群遗传距离较近聚为一个亚类，湖北、重庆分别列为两个亚类。甘肃种群与其余的5个种群遗传距离较远，单独聚为一大类。

图4 盾叶薯蓣居群的遗传多样性聚类图

Fig.4 Dendrogram of genetic diversity of Dioscorea zingiberensis

3 讨论

AFLP是近来出现的一项较新的分子标记技术，与RAPD、SSR等分子标记方法在检测DNA分子多态性比较，它对实验过程各项特别是基因组DNA的质量要求较高，但其结果的多态性好，效率高，重复性好，几乎每对引物都能产生多态性片段，其对基因组DNA的扩增是“半随机” 的（陶文静和刘大钧 1998）。所以AFLP标记技术已广泛应用于遗传多样性的分析（Das等 1999；Cresswell等 2001；Liu等 2003；Carr等 2003；Che等 2003）。实验证明：经多次扩增后，所得到的结果完全一致(Bellotti 和Arias 2001）。AFLP对DNA的质量要求较高，这影响双酶切的结果，从而影响选择性扩增的结果。实验采用经过改良的CTAB法提取DNA，加入β-巯基乙醇，以有效去除蛋白、多糖等次生代谢产物。经过抽提纯化后，保证了DNA的纯度。由于AFLP的众多优点，对盾叶薯蓣的遗传多样性的研究非常有效。

使用NTSYS-pc2.11F分析软件对30个薯蓣个体按遗传距离的差异进行聚类，从聚类图（图3）看，结果基本上能按照5个居群生长地区进行聚类，遗传距离的大小与地理位置的远近有着较大的相关性。有少数个体没按照来源聚类，分析原因，其中湖北的24号房县，27号陨西县，28竹溪县在地理位置上距离白河县比较近，可能是其聚入白河居群的主要原因。另外3，10，11属于岚皋居群，而聚入白河居群，其中的10和11是经过人工选育的优良品种，分析原因可能是在长期育种过程中对生长条件特点的适应上的相似性决定的，另外也可能虽然有些样品来自不同的居群，但最初来源可能是近代曾是同一居群（Gil-Vega等 2006）。

计算出总的遗传多样性Ht=0.2331、群体间遗传多样性（Dst）为0.1123、居群内遗传多样性Hs=0.1208，群体内的遗传多样性占51.82％，群体间的遗传多样性占48.18％，群体内的遗传多样性大于群体间的多样性。这可能是因为盾叶薯蓣雌雄异株，是典型的远交植物, 自交应该不会发生。参考Hamrick 和Godt（1990）对种子植物165属449 种植物的统计结果，单子叶植物Gst为0.231，特有种为0.248，狭域种0.242。盾叶薯蓣遗传分化系数（Gst）为0.4827，比平均结果高，说明其群体间存在一定的遗传分化。盾叶薯蓣居群间基因流Nm = 0.5418，说明盾叶薯蓣居群间遗传交换很弱，可能有如下原因：(1) 基因流主要通过种子、花粉两种载体发生，盾叶薯蓣种子和花粉传播距离特别短，野生状况下盾叶薯蓣种子的萌发率很低，而盾叶薯蓣花较小，其传粉媒介是一些飞行能力有限（飞行距离约在1-2千米的范围）或者无飞行能力的小型昆虫。(2) 生境的片断化、居群数目的减少及规模的缩小, 使居群间的基因交流以很小的几率发生（杭悦宇等 2003）。

运用POPGENE1.32软件对薯蓣5个居群进行聚类(图4)，结果基本上和单个样品的聚类结果一致，遗传距离最近的岚皋居群和白河居群首先聚成一小类，和湖北居群相聚，聚为稍大的类，又和重庆居群聚类，聚为更大的类，地理位置较远的甘肃的穿龙薯蓣和前面聚为一大类。从两种软件聚类方法均可看出，总的多态性比例、h 及I值均比较高，说明盾叶薯蓣遗传多样性比较高，且基本上能按照地理位置的远近进行聚类。

本实验是首次用AFLP的方法对盾叶薯蓣进行遗传多样性的分析的。前人研究（薛炎等 2006）结果得到户用RAPD分子标记所构建的聚类图显示样品间的遗传差异与地理来源的差异没有必然联系的结论，与本文有出入，而本文与文献（杭悦宇等 2003）的结果一致，即样品间的遗传差异与地理来源的差异有一定的联系。考虑原因可能与不同的标记方法有关，有待于进一步实验证实。

弄清物种的遗传多样性对资源开发和保护以及遗传育种都有重要意义。用 AFLP分子标记可以从DNA水平上揭示薯蓣遗传多样性，结合生态因子筛选出适合分布区内不同区域生长的薯蓣优良类型，为薯蓣的遗传育种提供理论依据，为合理利用和保护薯蓣质资源奠定基础。建议在采取有效保护野生资源的同时, 尽快建立全国性良种繁育基地，从根本上解决当前盾叶薯蓣资源保护与利用的矛盾。

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