确定流域面源污染的细菌源追踪技术应用初探

摘要：非点源排放具有随机性、无固定位置、排放量难以预见等特点，准确确定其来源、进行有效模拟及控制的难度非常大。特别是由病原体产生的非点源污染通过暴雨径流进入水体，给人体健康带来潜在的危害极大，由此引起的水安全事件已成为人类不可忽视的环境问题。通过介绍美国国家环保局推荐的、在美国广泛实施的一项新技术--细菌源追踪技术的研发及其应用状况，提出在我国的水资源保护管理中应开发应用这种技术，意在促进相关技术在国内的开发和昨用。

关键词：细菌源追踪；非点源污染；点源污染；水资源保护

中国分类号：TV213.4　  文献标识码：A

1 概述

细菌源追踪技术是一种新近发展起来的用于鉴定非点源特异性污染源的方法，通过对研究区内非点源污染物来源进行追踪鉴别和污染物产生量进行定量模拟，从而可以确定研究区域内不同非点源污染物的贡献率，将非点源污染控制问题转化成点源污染控制问题，为非点源源头控制和污染负荷总量控制提供有力的依据，保障研究区内水体满足水功能区要求，为水资源保护监督管理提供依据。这也是花钱少，成效高的解决问题的途径。

细菌源追踪方法的研究涉及到分子生物学、光学、化学等学科的许多基本理论问题和许多水污染控制的实际问题。它的发展在很大程度上取决于微生物学个体间表型、基因型，选择型差异研究的不断深入，以及数学手段在聚类分析研究中应用程度的不断提高。细菌源追踪技术已经逐步运用到水资源规划与科学管理和水质监控等领域中。

通过学习引起发达国家先进的细菌源追踪技术，可以弥补我国在非点源污染源鉴定、追踪、治理和控制等研究与应用方面的不足，缩短与西方发达国家环保科研水平的差距，科学有效地开展我国流域水功能区的水质目标管理和水资源保护规划工作，提高水资源保护规划水平，促进江河湖库水域功能区划管理和水体污染物总量控制政策的实施，实现我国经济的可持续发展。

2 细菌源追踪技术的发展

美国EPA1972年颁布的《清洁水法》303（d）条款对美国各州水域的水质标准和相应的最大日负荷总量（TMDL计划）的制定和实施都做了具体的规定。TMDL作为计算水体在满足水质目标的条件下能够接纳的最大污染物量及对污染源污染量的配置原则，可以根据TMDL计划制定满足供水目标应减少的污染排放量。在制定控制污染措施之前必须确定污染来源，点源污染源的确定相对容易，但非点源污染的确定缺少精确的技术支持。TMDL计划推动了细菌源追踪技术的研究与发展。1980年前后，在以美国为代表的发达国家开始了微生物源的示踪技术的研究。1996年，美国弗吉尼亚大学的环境学家Hagedorn和Wiggins首次提出“细菌源追踪方法”一词，将遗传生物学中追踪细菌污染的方法进行了总结，并按鉴别、分析、研究方式的不同分为分子（基因）方法和生物化学方法两大类。

分子（基因）方法都是依赖于“DNA指纹”，将不同种类的大肠杆菌或其子属独一无二的基因组份做为方法的基础。通过分析菌株特定的基因位点或染色体组的多态性（差异）判别污染物种类。该类方法主要包括特异性菌株聚合酶链式反应法（strain specific PCR）、16SrRNA基因法、寄主特异性毒素基因法（host-specific toxin genes）、噬菌体分型法（phage typing）、脱氧核糖核酸法（ribotyping）、脉冲电泳法（PFGE）、基因限制性片段扩增（RFLP）分析、重复序列聚合酶链式反应法（rep-PCR）、基因谱图法、DNA随机片段扩增法（AFLP）。这些方法都要对水体中的大肠杆菌进行选择性培养并建立数据库对细菌源追踪分析。

生物化学方法（表型方法）以微生物基因产生生化物质效应为基础，分析得出生化产物的类型和数量。通过这些特征的差异区分各个种属的大肠杆菌。常用的生物化学方法包括抗生素耐药性分析法（antibiotic resistance analysis）和碳源利用法（carbon source utilization）。这两种方法同样需要对水体中的大肠杆菌进行选择性培养并建立数据库完成细菌源的追踪分析。

分子方法能够提供不同来源细菌特异性最精确的结果，但缺点是分析每一个菌株样本的花费太高，实验过程太过细致，且时间周期长，在确定的时间段里对大批菌株进行分析虽然不合适。生物化学方法精确性虽不如分子方法高，但以其简单、快速、低成本等优势在短期分析中得以充分应用。可以选择生物化学方法确定出有大量粪源菌株的污染源，然后用分子方法对少量菌株用分子方法测定，得到最佳结果。

自细菌源追踪方法产生20多年来，从技术手段到非点源污染控制、管理、应用方面都不断完善。Schwartz和Cantor于1984年首先提出了脉冲电泳法，原理是将经过凝胶的连续电场改为脉冲电场，这就使百万兆基大小的DNA片段以特定的大小尺寸进行分离，同时使得片段的分析精确性更高。现已证实PFGE方法的鉴别能力相当高，在大肠杆菌的研究领域中占有很大优势。Haveleaar于1990年用噬菌体分型法进行追踪研究，选用特定大肠杆菌噬菌体F-specific RNA（FRNA）攻击的菌株来做分析，再用血清来区别这些大肠杆菌噬菌体来确定细菌来源[1]。Martin认为噬菌体分型法是简单、廉价且有效的细菌源追踪方法，但因实验性强，生物的可变性高，同时也因需要专业性强且经验丰富的实验人员而受到限制。目前4类FRNA大肠杆菌噬菌体：①包括牛、羊、猪和常见动物；②猪和人；③只有人；④鸟类和其它常见动物。目前，抗生素广泛应用于治疗人类感染的疾病中，动物饲料中也加入了抗生素[2]。细菌对于抗生素耐药性表现不仅存在于人类粪便，还存在于家禽褥草，牛及猪粪便中[3]，于是根据不同寄主细菌在暴露于不同种类与浓度的抗生素下会表现出不同的耐药性模式，分析特定动物群体内的菌丛具有抗生素耐药性的特殊“指纹”从而进行细菌来源识别的多组抗生素耐药性分析法应运而生。美国从1996应用多组抗生素耐药性法建立Page Brook流域数据库已经持续了4a之久，并且每一年都会向数据库里增加新的数据来评价污染的时空变化。初期1996-1998年平均分类正确率（ARCC）从88.5%下降到82.1%，但从1999年开始上升并且基本维持在85%左右。这种情况反应了对特定流域建立的已知源数据进行数据扩增时，抗生素耐药性分析方法在细菌来源追踪上的适用性。Carso在2001年研究发现，在区分人类与非人类来源的粪污时，ribotyping方法和多重抗生素分析方法是互补的，数据库数据增加时精确性也会增加[4]。

从世界范围看，美国、德国、加拿大等国家在污染源追踪方面的技术均比较先进[9]，其中，以细菌源追踪技术较成熟，美国环境保护局在全国大力推广，在不少州得到应用。目前，美国麦普技术公司（Map Tech,Inc.）正在进一步研究开发沉淀物来源跟踪技术（Sediment Source Tracking,SST）和营养物来源跟踪技术（Nutrient Source Tracking,NST）。

3 细菌源追踪技术的应用

细菌源追踪技术之所以受到科学工作者的高度重视，是因为它在某些情况下起着重要作用。当水污染事件发生时，它可以较准确地指明污染来源，不仅有助于公共健康的风险管理，还有助于管理者对突发污染事件做出快速的应急反 应，还能满足修订方案的需要，帮助指证环境污染的责任者[5]。

3.1 非点源污染来源的识别

随着工业废水和城市生活污水等点源污染得到有效控制，非点源污染尤其是农村粪便的非点源污染成为水环境污染重要来源。非点源污染的产生时间、方式、总量的不确定性给环境管理带来了很大困难，控制措施难以有效实施，导致非点源污染日益加剧，水环境质量不断恶化。传统的环境监测指标方法只能反映环境污染程度，不能确定污染源，特别是非点源污染。这就需要采用集监测、溯源和示踪为一体的细菌源追踪技术对非点源污染进行追踪分析，以便全面而清晰地掌握污染源。用细菌源追踪技术进行非点源污染的转化，是水环境质量管理科学决策的有效手段之一。目前，这方面的报导很多，Robin应用ribotyping法对Sapelo流域非点源污染追踪研究，发现50%的粪污染来源于流域附近的污水处理厂管道泄漏，其它少部分粪污染则来源于野生海鸟（白鹭和鹳类）[6]。Simmons等人用PFGE方法追踪来自一个城市分水岭处一条小溪细菌非点源来源并发现多数分离菌落来源于野生动物（特别是浣熊）和狗[7]。Wigginse和ARA方法建立一个村落地区的已知源数据库，取7个地点水样分离菌株与已知源数据库实行比对，发现有4个地点分离菌株来自于人类的菌株，另3个地点分离菌株里来自于狗[8]。值得注意的是，由于流域环境本身的复杂性，数据库的误差等因素，细菌源追踪方法并不能十分精确地分析出非点源污染物质的量。目前的技术只能分析出在某一时间段内各种非点源污染源所占污染百分比，进而概化成点源污染，而不是准确点源产生的污染量。

3.2 水质评价

水质评价是水质管理规划的基础，可用不同细菌源追踪方法对河流、海滨等水环境的质量进行评价。水质评价不仅可以得出水质满足不同使用功能的情况，而且还会给出水环境自净能力以及污染物浓度和时空分布。水污染评价已由传统的点源污染转向非点源污染，非点源污染的分散性、隐蔽性、随机性、难量化性等特点使得对受污染水的水质评价具有较大难度。传统的水质评价方法已经不能满足发展的要求，而发达国家经过20多年的研究已初步掌握了运用细菌源追踪技术监控和评价水质的技术。如Ericka.Jorgenson用ARA方法建立及检测了一个地区性的数据库，用于评价South Dakota湖泊及周围河流的水质[9]。

3.3 水质管理规划

水质管理规划是环境工程与系统工程相结合的产物。目前，数学模型在水质管理规划方法中，研究主要是针对泥沙、富营养化物质N、P和COD等，对细菌等有毒物质的负荷、迁移和转化等方面的研究很少。随着人类不断对粪便污染带来的各种负面影响认识的提高，运用细菌源追踪技术确定细菌类污水允许排放量的水质规划迫在眉睫。美国联邦政府和国家环境监管机构已将细菌源追踪技术作为水质管理规划的重要组成部分，并在全国范围内使用ARA技术鉴定粪便的大肠菌来源，从确定4种来源（即家畜、野生动物、人和宠物）的百分比来支持污染限排等政策实施。现有的研究也已证实用细菌源追踪技术支持、TMDL计划，进行污染负荷配置是最有效的方法。除此之外，在美国非点源污染控制决策中最受重视的BMP（最佳管理措施）也将细菌源追踪技术的分析结果直接应用到改善水质政策中，为流域水质管理做出了贡献。这些水质管理规划的成功应用案例都充分说明细菌追踪技术已经从研究领域过渡到了立法管理领域。

4 展望

非点源污染的形成与控制的研究是水环境承载力研究的一个重要方面，非点源污染对流域水环境污染的影响与贡献的基本状况不清将给流域环境规划带来很大困难。我国点源污染控制和管理体系经多年的努力已逐步完善，而非点源污染在我国日趋严重，防治还处在探索阶段。我国未来水环境的重要问题之一就是如何控制非点源污染，实现水质的根本改善。虽然目前还没有针对非点源污染防治的政策法规，但将非点源污染防治纳入总量控制势在必行。在国外，应用细菌源追踪技术对非点源污染进行追踪、识别在环境治理中发挥了重要的作用。细菌源追踪技术使得非点源污染的分散性、隐蔽性、不易监测、难量化性等不再是治理非点源污染的瓶颈。它的先进性主要表现在：①它将分子生物学、生态学、统计学等学科有机地结合在一起，能把非点源污染监测转化为点源污染监测；②可有效鉴定水体中细菌污染源种类的百分比，判定其来源；③通过细菌源数据库数据分析，可鉴别污染源；④鉴于细菌源追踪技术的精确性，其分析结果有助于公共健康的风险管理，帮助管理者对突发污染事件做出快速的应急反应。

在学习国外先进经验及技术的同时，应结合我国国情，笔者认为应首先考虑以下几个方面：

（1）我国应分重点来实施细菌源追踪技术，应先在发达地区、监测条件和技术条件好的地区，率先实施细菌源追踪技术；对水体污染比较重的，尤其是水源地受非点源污染威胁的水体应尽快应用细菌源追踪技术。

（2）使用细菌源追踪技术时应注意方法的选择，尤其应注意方法的优缺点及适用空间尺度。

（3）细菌非点源的追踪结果应与控制措施相结合，使其一体化。

利用细菌源追踪技术对非点源来源进行追踪，在非点源污染综合控制方面取得了显著成效，在控制与管理非点源污染方面具有巨大的生命力，在我国将有广阔的应用前景。

参考文献：

[1] Hagedorn, C. Bacterial Source Tracking (BST)Homepage.<http://soilsl. cses. vt. edu/ch/biol_4684/bst/BST. html >. Accessed 2001april23.

[2] Bryan.,N. Shapir and M.J. Sadowsky. Frequency and distribution of tetracycline resistance genes in genetically diverse, nonselected, and nonclinical E.coil strains isolated form diverse human and animal sources.Appl,Environ.Microbio,2004.70:2503-2507.

[3] Kelly T.R.,O.C. Pancorba, W.C. Merka and H.M. Barnharts. Antibiotic resistance of bacterial litter isolates. Poultry Sci,1998.77:243-247.

[4] Carson, C.A.,B.L. Shear, M.R. ellersieck and A. Asfaw. Identification of fecal Escherichia coli from humans and animals by ribotyping. Applied and Environmental Microbiology,2001.67:1503-1507.

[5] 王耀兵，关道明.我国近岸海域微生物源示踪监测技术的研发.海洋环境科学，2006，35（3）：67-70.

[6] Robin L. Kuntz, Peter G. Hartel, Dominique G. Godfrey.Jennifer L. McDonald, Keith W. Gates, and William I. Segars. Targeted Sampling Protocol as Prelude to Bacterial Source Tracking with Enterococcus faecalis.environ.qual2003.32:2311-2317.

[7] Simmons. G.M Estimating nonpoint fecal coliform sources in Northern Virginias four Mile Run watershed. Water res,2000,34(3):248-267.

[8] Wiggins, B.A. Microbial source tracking using antibiotic resistance analysis. U.S. EPA Workshop on Microbial Source Tracking.Irvine,CA.2002.

[9] ErickA. Jorgenson. Use of antibiotic resistance ananysis as a bacterial source tracking technique to facilitate water-resource management in south Dakota,2005.