转基因植物对有机污染物的吸收、转化和降解

　　土壤、水体和大气中残留的有机污染物，如来源于石油的烃类、多氯联苯、多环芳烃、含氯溶剂、炸药和有机农药等，大多数属于持久性有机污染物persistent  organic  pollutants，POPs)；它们具有化学性质稳定、难以被生物降解和容易在生物体中富集等特点。这些有机污染物不仅会使农作物减产或绝收，而且还会通过植物和动物进入食物链，对生态环境造成有害影响(易筱筠等2002；杨柳春等2002)。另一方面，有机污染物在人体内积累后有可能引起癌症、畸形和神经系统疾病等多种疾病，严重威胁人类的生存和健康。近年来，我国的整体环境质量在不断改善，但许多地区由有机污染物引起的污染现象却日益严重，环境污染治理与修复刻不容缓。  

　　对污染环境的修复有不同的途径，包括物理的、化学的及生物的途径。植物修复、微生物修复和动物修复属于生物修复的范畴，是最有生命力的修复技术(丁克强等2000)。其中，植物修复技术是利用植物消除由有机毒物和无机废物造成的环境污染(Anderson  1993)，被认为是一种经济、有效、非破坏性的环境修复方式，有着很大的应用前景(Alkorta和Garbisu  2001)。植物能够直接吸收有机污染物，然后再经过不同的途径去除这些物质。植物也可以分泌各种酶类，通过酶的催化作用来转化或降解有机污染物。同时，植物可以将有机污染物吸附在根的表面，与根际微生物协同作用实现对有机污染物的降解。然而，不同性质的污染物被去除的过程不尽相同(刘世亮等2003)；疏水性有机污染物易被根表面强烈吸附，但不能向植物体内转移，只能富集在根系表面；亲水性强的有机污染物容易被植物体吸收，几乎不经过吸附过程就直接进入植物体内。有机污染物被吸收后，会有多种去向(桑伟莲和孔繁翔1999；沈德中1998)。一些有机污染物被植物分解，其产物参与植物体的代谢过程，或转化成无毒性的中间代谢物，并储存在植物细胞中，或者完全降解，矿化成CO2和H2O；有些有机污染物在植物体内与其它有机化合物形成无毒的稳定复合物；还有一些有机污染物经木质部转运，随后通过植物的蒸腾作用从叶表挥发。  

　　然而，植物所具有的生物修复能力非常有限，要达到应用的水平，还需大幅度提高植物对有机污染物的吸收、转化和降解水平，改善影响生物修复效率的主要因素。近年来，植物转基因技术的发展为植物修复技术的应用提供了良机。很多研究者试图将转基因技术用于改造植物的特性，以增强其在吸收、富集、转化和降解有机污染物方面的能力。随着转基因技术的发展和人们对植物降解有机污染物机理的深入了解，人们改造植物的能力将会越来越强，一大批更加适合污染环境修复的转基因植物将会陆续出现。  

1  转基因增强植物对有机污染物的耐受能力  

　　植物对有机污染物的耐受能力是其能否在污染环境中正常生长的首要因素。当体内污染物浓度达到一定的高度时，植物就会表现出受伤害的症状。耐受能力差的植物不适合用于修复污染环境，这类植物即便是对污染物有很强的吸收效率和富集能力，也会因为污染物毒害的不断加重而无法正常生长(Baker和Brooks  1989)。  

　　在自然界，有些植物如柳树对苯达松(bentazon)等有机污染物的耐受能力极强(Conger  1997)。在同一种植物中，不同植物品种或生态型对有机污染物的反应差异也很大。在筛选有净化能力的植物时，往往有这样一类植物，它们对一种特定污染物有吸收和转化能力，但是对这类污染物的耐受能力却很弱。有些植物对特定的污染物降解作用，但是在该污染物存在时本身却无法正常生长(Pavlostathis等1998)。因此，植物对有机污染物的耐受能力是其是否有环境修复价值的关键因素。  

　　通过转基因的办法能提高植物对特定有机污染物的耐受能力。土壤中残留的除草剂是土壤的一大污染源。研究者们用转基因技术提高农作物对有机污染物的耐受能力，使它们对除草剂的抗性大大增强。例如，Inui等(1999)将人的CYP1A1(cytochrome  P450  monooxygenase)基因转入马铃薯后增强了植物对多种除草剂的抗性。目前，在外源有用基因中，来源于微生物的基因占有很大比重。Hannink等(2001)将微生物硝基还原酶(nitro-reductase)基因转入烟草后观察到转基因植物能提高植物对TNT(2,4,6-Trinitrotoluene)的抗性。TNT作为爆炸残留物在土壤内残留时期相当长，对土壤、水源和大气环境的潜在威胁很大。将野生型和转基因烟草发芽后分别置于不同浓度TNT的MS培养基上培养，结果发现，在含有TNT  0.1  mmol/L培养基上野生型烟草的生长基本被抑制，而转基因烟草的生长状态依然良好。Wang等(2004)在拟南芥中过量表达棉花分泌型漆酶后增强了植物对酚类化合物的抗性。转基因拟南芥的根在含有酚酸类物质的培养基上伸长快。测定结果表明，漆酶活性与酚酸类物质的抗性之间成正相关。由此可见，漆酶基因的表达是植株产生抗性的直接原因。有机态的汞容易通过食物链危害人的中枢神经系统，具有重金属和有机污染物的双重危害作用。Tian等(2002)将细菌中催化甲基汞转变为离子汞的merB基因进行序列改造，通过农杆菌的介导转入烟草，其转基因植株后代对有机汞表现较强的的抗性。在水培条件下，有些转基因株系能抵抗2.5  μmol/L醋酸苯汞(PMA)，而野生型烟草幼苗在0.1  μBmol/L的PMA条件下会很快死亡。  

　　越来越多的研究结果都表明：通过转基因能够提高植物对特定有机污染物的抗性(Doty等2000；Yamada等2002a；Inui等1999)。应当看到，人们对转基因植物进行生物修复的研究还处于起步阶段，许多有关的理论问题还没有解决。例如，来源于动物和微生物的外源基因在植物体内是如何表达和起调控作用的?改造基因序列和植物表达载体结构能够在多大程度上提高植物抗性?转基因植物耐受有机污染物的分子生物学机制和生理机制如何?回答这些问题仍需要很长的时间和艰苦努力。  

2  转基因提高植物对有机污染物的吸收和转化能力  

　　很多植物原来就有吸收和转化特定有机污染物的能力，但是这种吸收和转化的效率比较低。在无菌条件下水生植物鹦鹉毛  (Myriophyllum  aquaticum)、浮萍(Lemna  minor)、伊乐藻(Elodea  cnadensis)可以富集水环境中的DDT[trichloro-2-(o-chlorophenyl)-2-(p-chlorophenyl)ethane]，并将它降解为DDD[dichloro-2-(o-chlorophenyl)-2-(p-chlorophenyl)ethane]和DDE[dichloro-2-(o-chlorophenyl)-2-(p-chlorophenyl)-ethylene](Gao等2000)。热带豆科树木Leuceana  leticocephala  var．K636能吸收EDB(ethylene  dibromide)和TCE(trichloroethvlene)(Doty等2003)。Pascal-Lorber等(2003)发现大豆和小麦能吸收和降解二氯酚和二氯苯胺。Hannink等  (2001)将微生物硝基还原酶(nitro-reductase)基因转入烟草大大促进了它对持久性有机污染物TNT的吸收。他们将野生型烟草植株和转基因烟草植株同时置于TNT  0.1  μmol/L的培养基上生长，经检测后发现，7  d后野生型烟草吸收了培养基中约80％的TNT；而转基因烟草6  h后吸收了71％的TNT，20  h后培养基中TNT被完全吸收。当野生型和转基因烟草植株同时置于TNT  0.25  μmol/L的培养基上生长时，野生型烟草基本不吸收培养基中的TNT，而转基因植株6  h后吸收了50％的TNT，72  h后培养基中TNT被完全吸收。Doty等(2000)将人的P450  2E1基因(编码一种细胞色素氧化酶)转入烟草后，研究了该转基因植物对TCE的吸收和转化作用。他们将该转基因烟草植株和对照(空载体转化烟草)植株在含有118  μg  TCE/mg的水溶液中培养5d，转基因烟草植株根组织中明显含有TCE转化产物三氯乙醛和三氯乙醇，而对照植物(用空载体转化过的)中几乎检测不到这些物质。转基因植物中三氯乙醇的平均含量，根中是对照的149倍，叶中72倍，茎中是44倍。三氯乙醇的毒性远远低于TCE，而且在植物体内不很稳定，还会降解成小分子的有机物。将这些处理过的植株清洗去掉TCE后置于无菌营养液中培养，5d后收集植物材料，抽提后用GC-ECD分析，结果根中91％的三氯乙醇消失，茎中是94％，而叶中为37％。这种消失被认为是三氯乙醇降解的缘故。通过对多个转基因株系研究还表明，转基因植株中，三氯乙醇的量和CYP  2E1基因的表达量成正比。其它研究者的研究结果也表明，通过转入外源基因可以使植物获得转化特定有机污染物的能力(Shimizu等2002)，并且这种增强作用是由于外源基因的过量表达引起的。当然，这类转基因植物在田间栽种时对TCE是否具有同样的吸收和转化效率，还需要实地研究。  

3  转基因提高植物对有机污染物的降解能力  

　　植物除了通过转化作用将所吸收的有机污染物转化成无毒的其它有机物外，也可以通过降解作用使其分解为无毒的小分子化合物。最理想的方式是将大分子的有机化合物经生物降解转化成H2O和CO2。杨树在人工控制的现场实验中能够去除湿地中99％的三氯乙烯(Newman等1999)；热带豆科树木Leuceana  leticocephala  var．K636能降解EDB(二溴乙烷)和TCE(二氯乙烯)(Doty等2003)；鸭茅(果园草)(Dactylis  glomerata)能加速除去二甲(苯)酚和三甲(苯)酚等有机污染物(Rasmus-sen和Olsen  2004)；大米草(Spatina)可以吸收有机汞，将有机汞部分地转化为无机汞(田吉林等2004)。关于植物对有机污染物的吸收和代谢等作用，Newman和Reynolds(2004)曾做过较全面的阐述。  

　　植物、动物和微生物中有多种降解有机污染物的物种，它们体内可以发生一系列有用的生物化学反应。人们相继发现很多能够降解有机污染物的酶类，如：细胞色素P450单加氧酶、过氧化物酶、漆酶和脱卤素酶等。通过转基因技术已经将有些有用基因转入植物。有些基因能够极大地增强植物对有机污染物的降解能力。French等(1999)将一个微生物的五赤藓糖醇四硝酸酯还原酶(pentaerythritol  tetranitrate  reductase)基因转入烟草后检测到该植物对五赤藓糖醇四硝酸酯和甘油三硝酸酯的脱硝基能力大大提高。他们将转基因植物和对照植物体的抽提液置于含五赤藓糖醇四硝酸酯的溶液中，60  min后检测亚硝酸盐的产生，其中转基因植物产生量最大的达到1.4  mol亚硝酸盐/mol五赤藓糖醇四硝酸酯，对照组中则几乎检测不到亚硝酸盐的产生。另外，他们将转基因种子和野生型种子发芽7d后，置于含有甘油三硝酸酯的烧瓶中培养，用HPLC检测溶液中甘油三硝酸酯的减少量和其代谢产物甘油二硝酸酯和甘油一硝酸酯产生量。结果表明，五赤藓糖醇四硝酸酯还原酶的转入大大提高了烟草的脱硝基能力。此外，除草剂降解方面的结果表明，通过转入特定外源基因能够增强植物降解除草剂的效率。Yamada等(2002b)将老鼠的CYP1A1基因转入马铃薯使植株对除草剂的降解能力大大增强。Inui等(2001)发现将人的CYP1A1、CYP2B6和CYP2C19等基因转入马铃薯使其对除草剂和其它一些污染物的降解加强。Kawahigashi等(2002)将人CYP2B6基因转入水稻后，使其对除草剂呋草黄(ethofumesate)的降解作用增强了至少60倍。  

　　植物从外界吸收各种物质的同时，也不断地分泌各种物质。这些分泌物成分非常复杂，其中包括一些能够降解有机污染物的酶类。植物分泌的酶类对有机污染物有一定的降解活性，从而对有机污染物的环境污染起修复作用(Salt等1998)。Yoshitami和Shann(2001)通过实验证明了这一点。他们观察到玉米(Zea  mays  L.)根的分泌物能够促进芘(pyrene)的矿化作用。而且，不同诱导条件下植物分泌产物的组成不同(Gleba  等1999)。采用强启动子可以使分泌物的含量增加，也可以使植物分泌物中特定组份增加。这些技术已经部分用于增强植物修复能力的研究中。Wang等(2004)将35S启动子驱动的棉花GaLAC1(GaLAC1基因编码一种分泌型漆酶)转入拟南芥中，转基因植株的根部漆酶活性比野生型高约15倍，分泌到培养基中漆酶的活性高约35倍。Yamada等(2002a)使用未成熟块茎特异性表达启动子class-1  patatin使老鼠CYP1A1基因在马铃薯块茎中特异性表达。Gleba等(1999)用根特异性表达启动子和分泌性信号肽使植物分别大量分泌多个异源基因表达的蛋白。这些方法都可以用来增强植物修复环境的能力。  

　　虽然植物的生物降解作用相当广泛，但是与此有关的基因却知之甚少，其作用机理还不清楚。同微生物相比，植物的生物降解作用要复杂得多，涉及的基因网络复杂得多。在这种情况下，微生物中大量生物降解基因的存在将会给我们多种选择。结合高等植物的特点，分析植物生物降解基因的同源基因，研究它们的生物学功能，在此基础上发现新的生物降解基因。这一方面有助于人们了解植物降解有机污染物的原理，另一方面将大大增加植物源生物降解基因的利用，增强转基因植物对有机污染物的降解作用。  


4  转基因植物在污染环境修复上的应用前景  

　　虽然自然界现存的植物类群中，有能对有机污染物吸收、富集、转化和降解作用的植物种类。但是它们的作用效率比较低，很难达到应用的水平；例如，某些树种对氯代烃如三氯乙烯有吸收和降解作用，但是其降解效率太低，因而无法用于环境修复；而有些个体小的植物虽然有很高的吸收效率，但是由于其生物量太小，也限制了其在环境修复中的应用(Hannink等2001)。只有当植物对有机污染物的吸收、富集、转化或降解水平达到一定高度时，才有大规模应用的价值。另外，污染环境中的有机污染物多种多样，其存  在形态也很复杂。因此要成功修复被有机污染物  污染的环境，所应用的植物必须具备多种特性：对一种或多种污染物有很强的吸收能力；对一种或多种有机污染物有很强的耐受能力；吸收进入植物体的污染物能最终被降解或集聚并固定在特定的植物器官中：有合适的根系和比较大的生物量，易于栽种，且其生长和繁殖不会破坏生态环境。虽然现存的植物中，有些已经具备了以上的某些特征，但目前为止，还没有发现哪种能够达到上述全部标准的植物。  

　　在植物修复中，很多植物只能将污染物转化成另一种形式，而不能完全降解。类似的情况也发生在转基因植物上。这是因为，有机污染物完  全降解的途径往往需要多个酶共同作用才能降解完  全。而大多数污染地区都是多种污染物的复合污染。这就要求用于修复的植物能够同时修复多种  污染物。虽然天然的植物如杨树能够修复多种污  染物质的污染，也能够彻底降解一些污染物；但是因为污染物很多，即使能够修复多种污染物，仍然会有不能降解的污染物。针对特定的有机污染物和不同的复合污染，很难，甚至不可能在自然界里找到合适的修复植物。然而，多基因转化技术的逐渐成熟，让我们能够按照环境的要求“创造”目标植物。我们可以将为降解特定有机污染物所需的基因全部转入修复植物使其获得完全降解有机物的能力；也可以将修复不同污染物的基因同时转入同一修复植物，使其具有修复复合污染的能力。  

　　获得多基因转化植物的方法很多，最简单的方法是通过多次转化获得。虽然单基因转化已经是比较成熟的技术，但是因其多次转化需要的时间长效率低而不可取。构建多基因植物表达载体是一种获得多基因转化植物的办法(Tircoli等1995；Chen等1998；Wu等2002；Campbell等  2000)。Siminszky等(2003)同时转入大豆CYP71A10和P450还原酶能使烟草对苯尿(phenylurea)型除草剂降解能力提高20％-23％。这项技术的发展水平已经表明，能够通过转基因的方式获得对多种污染物有降解能力的修复植物，同时也可能将降解同一污染物的代谢途径中的多个基因同时转入植物以使其能够完全降解这种有机污染物。  

　　在运用植物修复技术时，选择合适的植物相当重要，因为有生物降解能力的植物不一定适合用于修复有机污染物污染的土壤或水体。比如，虽然水葫芦对有机污染物有降解能力(刘建武等2003)，但是由于水葫芦的过度生长繁殖会影响生态环境(Matagi  2002)，因此须将水葫芦的生长速度控制在一定限度之下才能适合用于环境修复。由于转基因技术能够使植物获得修复特性，因而转基因所用的受体植物本身就不一定要有修复污染环境的能力；这样我们就可以尽量选择有其它优势性状的植物，如：不具入侵生物特性、生物量较大和根系较深等。现阶段用于环境修复研究的植物基本局限于本身有修复能力的植物。但是许多植物所具有的环境修复能力，可以通过生物降解基因的转移来实现。这样，植物修复可供选择的植物种类就大大增加，我们就更有机会获得更好的用于环境修复的“优势植物”。  

　　有些学者希望通过杂交的方法把不同亲本的优良性状能够结合在一起，从而获得应用价值更大的后代(Gleba等1999)。如果将不同性状的转基因植物进行有性杂交，使其同时具有多种有利的修复性状，那么，它们在环境修复方面的利用价值就会大大提高。然而，因为杂交本身的局限性(如无法杂交等)，人类所需要的优良性状不一定都能够通过杂交获得。因此，将转基因技术与传统育种方法结合起来，会加快转基因植物在污染环境修复上的应用。  

　　如前所述，在微生物中发现了大量的能够降解有机污染物的基因，但是还有很多有机污染物至今尚未找到降解它们的基因。从植物中克隆生物降解基因是一项紧迫的研究工作，它对于获得高效表达和修复能力强的转基因植物至关重要。获得特定降解基因的前提是对有机污染物降解途径的了解。只有了解有机污染物的降解途径，我们才能克隆到完全降解有机污染物所需要的基因。可以期望，随着大量有机物降解基因的发现和植物转基因技术的发展，构建用于修复有机污染物的理想植物的障碍将渐渐扫除，转基因植物将在生物修复中展示其强大的威力。  


5  转基因植物用于环境修复的安全评价  

　　转基因植物给我们带来巨大利益，包括提高粮食产量、产生大量各种用于医药的物质和修复污染环境。同时，它也存在一些安全隐患。主要表现在，转基因生物所含的外源基因对人类本身基因组的影响，它所携带的抗性基因(主要是抗抗生素基因)会影响人体内的正常菌群。转基因作物给野生种造成危害，造成生物多样性的丧失，它可能会因为适应性高而成为入侵种；同时转基因植物中的抗性基因渗入近缘杂草会提高这些杂草的适应能力，从而造成所谓“超级杂草”的出现；转基因植物在消灭特定害虫时，也会影响昆虫生态平衡。从现有的生物学知识看，直接食用转基因食品不会污染人类自身基因。  

　　现阶段人们对转基因植物的争议大多是关于转基因作物的大面积栽种以及大量的转基因食品流入市场所带来的问题。用于修复环境的转基因植物不同于用作食品的转基因作物之处是：它可以不作为食物直接进入食物链(但是也有可能通过进入食物链而间接被人们食用)，因此对人体健康不会构成直接威胁。对于这类转基因植物的安全性评价重点应当关注它对自然生态环境的影响。某些转基因植物能够大量富集有机污染物，对这些转基因植物的回收和处理将是环境修复的技术关键。我们还要考虑到，转基因植物是否会与同种野生植物或其亲缘种杂交，影响生物多样性。虽然已经有学者提出这种危险性的存在，但是更多的学者认为这种结论缺乏确切的证据(ChriStou2002)。不过，转入外源基因的植物一旦散布到自然界便无法控制，所造成的损失也无法挽回；因此，在使用特定转基因植物净化环境时，必须仔细评估它的生态效应。转基因植物是否会因为其性状的变化而改变成为入侵生物，从而改变生态环境对这种新环境是否有效的遏制因子Williamson1994)?一般情况下，用于修复目的的转基因植物在特定污染环境下生存能力较强，并表现出很强的生物修复能力，在无污染或低污染的环境下则没有特别的生长优势。当土壤和水体污染水平降低时，这些转基因植物的生长发育速度将接近野生型植物。因此，与同类野生型植物相比，它不会有更大的成为生物入侵种的趋势。我们也不应该因为转基因植物可能带来危害而放弃转基因植物在修复污染环境中的运用，而应该考虑如何发展和“创造”安全有效的用于修复环境的转基因植物。  

　　在利用转基因植物修复被污染的环境时，污染物可能会通过食用被污染的植物的动物进入食物链(唐世荣和Wilke  1999)。如果能使植物吸收的污染物不在果实和种子中富集，就可以在很大程度上减少这类问题出现的可能性。用植物组织或器官特异性表达启动子能够使外源基因只在特定组织或器官表达。因此，基因特异表达技术可以为这个问题的解决提供技术支持。已经有很多研究者利用不同特性的启动子研究目标基因的表达；通过选择特定的启动子，他们使所转化的目标基因在植物特定的组织或器官特异表达(Liu和Ekramoddoullah  2003；Dinant等  2004)。有些研究者已经将组织或器官特异性表达技术用于研究有机物污染物降解基因。虽然基因组织特异表达技术在环境修复研究中的应用还很少，但其技术特点表明它在特定的环境修复中发挥一定的作用。