分子生态学的原理和方法

2　分子生态学的主流任务是在分子水平上研究种群与环境的相互作用

　　生态学研究的生物有机体是一个层次复杂的生命系统，个体物种在宏观水平上能够体现出生命有机体新陈代谢、自我繁殖、自我调节，变异进化等生命的基本特征，但不能表征由于所处环境的异质性而导致的不同环境中同种个体在新陈代谢、自我繁殖、自我调节、变异进化等方面的差异。事实上，任何一个个体物种都不是以单一个体的形式存在于自然环境中，而是以群体物种的形式有存在于自然环境中。生态学上将同种生物在特定空间的个体集群称为种群，它既有数量特征和空间特征，又有遗传特征，即有一定的遗传组成，世代传递基因频率，通过改变基因频率来适应环境的不断变化，它是生态层次的基本结构单位，也是生态系统的基本功能单位。从分子生物学的角度上看，种群是指能自由交配和繁殖的一群同种个体，它在一定的时间内拥有全部基因的总和称为该种群的基因库（Gene pool），而携带的全部遗传信息的总和又称为该种群的基因组（Genome）。结合生态学和分子生物学对种群的定义和理解，分子生态学也将在分子水平上，从结构研究（分子基础和功能研究）和分子机制两方面来研究种群与环境的相互作用，并将其作为该学科的主流任务。

2．1种群基因型与表现型的分子基础

　　在分子水平上研究种群与环境之间的相互作用，首先要研究种群的基因与环境的相互作用。种群内个体基因组成叫做基因型（Genotype），由相同的显性基因或相同的隐性基因组成的基因型叫做纯合体（Homozygote）；有一个显性基因和一个相对的隐性基因组成的基因型叫做杂合体（Heterozygosity）。种群内个体的基因型通过与内、外环境相互作用，使其基因控制种群新陈代谢中的一系列生化反应影响种群的发育，从而决定种群的形态特征和生理功能等形状的形成，产生表现型（Phenotype）。因此，表现型是基因型与内、外环境相互作用的结果，基因型是决定表现型的遗传基础。由于DNA转录及RNA的翻译过程中存在着DNA与RNA间以及RNA与氨基酸序列间的对应关系，而功能蛋白质的结构却不一定由其氨基酸序列决定。基于这种特性，可以认为，表现型的基因表达始于蛋白质的形成。然而，DNA中只有部分被转录成RNA，形成的RNA中也只有部分被加工成mRNA并翻译成蛋白质，其余RNA则被降解或形成功能产物如rRNA、tRNA。因此，DNA、RNA及蛋白质之间的对应关系也有一定差异，而且这种差异随种群内个体的不同有所不同。虽然RNA是由DNA转录产生的，但二者之间质和量的表达均有差异，因而导致了种群内个体表现型的差异，这说明表现型的差异受基因型的影响，是基因与环境之间相互作用的结果（五亚馥，戴灼华，2002）。一般说来，环境因素所诱导的表现型类似于基因突变所产生的表现型，这种现象称为拟表型（Phenocopy），一定基因型的个体在特定的环境中形成的预期表现型比率称为外显率（Penetrance），而杂合体在不同的遗传背景或环境因素影响下个体间基因的表达程度则为表现度（Expressivety）。

2．2种群遗传结构的分子基础

　　在分子水平上研究种群与环境之间的相互作用，还要研究种群的遗传结构，即种群中各种基因的频率以及由不同的交配体制所带来各种基因型在数量上的分布。种群遗传结构的一个最基本的测试就是基因频率（Gene/Alleles frequency），它是种群内某一等位基因占该位点上等位基因总数的比率，而基因型频率（Genotype frequency）则表示种群内不同基因型所点的比例。基因频率和基因型频率是种群遗传结构的基本标志。自然种群的遗传结构分析表明，种群内大多数基因位点上存在一系列的等位基因，它们以不同的频率存在于种群中。所以，种群内大多数个体在多数位点上是不同等位基因的杂合体，这种杂合性是种群遗传结构的基本属性之一，它在同一个体中表现为等位基因的异质结合，在个体之间表现为等位基因之间的差异。因此，种群的杂合性可以保证种群的多样性（沈银柱，2002）。

　　假设在没有自然选择、没有迁移（Migration）、没有突变的理想条件下，一个足够大的种群在个体间进行随机交配的过程中，从一代到另一代，没有基因频率和基因型频率的变化，这就是著名的Hardy-Weinberg基因平衡定律。这一定律指出，在研究种群的遗传结构发生变化之前，种群的遗传本身并不发生变化。然而，在自然种群中，这种理想的条件实际上是不存在的，自然选择、迁移和基因突变均在有性繁殖过程中对种群的遗传结构变化产生影响，因而导致基因频率和基因型频率发生变化，并将这种变化传递到未来的世代中去。例如，基因突变本身就是影响种群基因频率的一种力量，同时也会自然选择提供了原始材料，如果突变从一个纯合体开始，那么，突变压则要增加遗传变异直到有两个相对的突变率所决定的每个基因的平衡值出现为止；再如：自然选择的过程是与种群对环境的适应相关的，因为具有与环境适应较好的表现型的种群在竞争中有更多的生存机会，从而留下较多的后代。在种群中，一个已知基因型的个体，把它们的基因传递到其后代基因库中去的相对能力就是该基因型个体的适合度（Fitness），也叫适应值（Adaptive value），表示一种基因型的个体在某种环境下相对的繁殖效率或生殖有效性。相反，在自然选择作用下某一种群降低了适合度，因而不利于某一基因型在该种群中生存的程度叫选择系统（Selective coefficient），也叫选择压（Selection pressure）；又如：在自然条件下，基因突变和自然选择往往会在一个种群中同时起作用，若这两种作用相同，该种群改变供其基因频率的速度加快，若这两种作用不同而相互抵消，该种群的遗传结构将处于稳定的平衡；还如：迁移，也叫基因流动/漂移（Gene flow），是迁移种群在迁入地参与土著种群的交配繁殖而导致基因在这两个小种群间的流动，进一步引起迁入地种群基因频率的变化；最后，如果某一种群规模很小，对其随机取样时产生的误差可造成该种群基因频率的随机波动，称为随机的遗传漂变（Random genetic drift），它可能固定一个不利于该种群的等位基因，也可能淘汰一个对该种群有利的等位基因。

2．3种群遗传多态性的分子基础

存在于任意种群内的遗传变异可以在不同层次上表现出遗传多态性及分子多态性。首先，如果DNA序列中某特定位点的变异频率低于1%称为基因突变，高于1%称为DNA序列多态性，包括微卫星DNA的多态性，它源于其核心序列的重复次数不同，重复次数越多，提供的信息量越高，是一种多等位基因形式的多态性；单核苷酸多态性（SNP），是指由单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子多态性，有时也包括由多个核苷酸插入或缺失造成的点，是一咱双等位基因形式的多态性；ALUL序列多态性，是一种短的重复序列。其次，在结构基因编码的多肽层次上，如果以结构基因上有一个非冗余MM子，如由GGU到GAU，那么多肽在翻译时就将有一个氨基酸被替换，因而表现出蛋白质多态性。另外，一个基因若在一个种群内有多于一种形式，它就是基因多态性，以种群中多态基因的比例来表示基因多态性的大小。

2．4种群生态适应与生态进化的分子机制

　　生态适应（Ecological adaptation）和生态进化（Ecological evolution）是生态学中的普遍生态现象和基本生态过程，是生态学研究的核心内容。生态适应与生态进化的实质是生物与环境之间的信息交换，即生物与环境之间产生的信息传递在生物的结构和功能方面表现出以自我调节为特征的生态适应，其产生的信息积累则表现在生物的结构和功能方面出现以始祖基因通过加倍与大规模的遗传扩展，而使其有序度和组织程度提高为特点的生态进化。生态适应和生态进化表现在生物微观和宏观的各个层次上，但基本的结构和功能单位是种群，基本的原因是种群所携带的遗传信息在环境的影响下所发生的逐代改变。因此，种群在外部形态结构表现出的复杂性和多样性的增长或生理功能上表现出的强化、扩大和更替等生态适应和生态进化特征，在生物大分子水平上均具有内在的分子机制。

　　从分子生态学的角度来看，种群基因组里包含的遗传信息不是固定不变的，实际上基因组总是处在一种动态的稳定状况中。首先，外界环境因素（宇宙射线、紫外线等）均能使基因组产生新的变异，导致基因组中的基因突变；其次生命有机体所处环境中的遗传物质可以通过各种方式进入基因组；第三，基因组中相当大部分的基因是由重复序列构成的，大量重复序列的存在，可弥补由于基因结构不稳定而引起的基因丢失。这表明基因组具有很大的可塑性。在基因组内，携带遗传信息的不仅有结构基因，还有操纵基因和调节基因。结构基因是具有储存遗传信息MM功能的基因，调节基因可能调节结构基因的作用和功能，而操纵基因既控制结构基因合成信息RNA（mRNA），又受调节基因产生的阻遏蛋白控制。当阻遏蛋白与操纵基因结合时，结构基因就不能发生作用。但是，在外界环境或其它物质与阻遏蛋白相作用时，即推动对操纵基因的抑制作用，于是操纵基因乃与结构基因结合，就恢复了结构基因的作用，重新合成蛋白质。此外，在基因组内，编码各类结构蛋白的结构蛋白基因多数为组成型表达类型，由环境诱导而特异表达的基因为优势表达类型。其中，环境诱导基因是种群由于内、外环境的变化，以及外部各种胁迫而诱导表达的一类基因。对于植物种群而言，虽然外界环境为植物种群提供了必备的生存条件，但植物种群还必须存在一套防御机制适应环境不利因素的出现。在这个过程中，环境诱导基因的表达起着关键的作用。用于环境诱导基因的诱导因子主要包括激素、温度、病原、水、光等。这说明，种群基因组并非表达所有的基因，被表达的基因类型即表达程度随种群所处的环境和生理状态的不同而表现出极大的差异，且这种差异存在着严格调控的时空特异性，这使人们越来越认识到基因组与环境间的相互作用无时无刻不存在，基因突变和多态性的产生又总是与环境的影响分不开。由此看来，在种群生态进化分子机制的研究中，从整体上研究基因组，着眼于种群整个基因组的所有基因，分析整个基因组的碱基序列，整体阐明包括中性突变和环境诱导在内的生态进行基因表达谱，即可深入探索生态进化中的“多重调控”和“调控网络”的分子机制。

　　从分子生态学的角度来看，种群蛋白质组中的蛋白质可分为结构蛋白和调节蛋白两大类。与基因组中存在大量重复基因而导致信息冗余一样，蛋白质组也存在着大量的信息冗余，同样具有重复多拷贝性和容量可调节性的特点。当种群受到外界某种不良的环境因素影响而遭受损失时，蛋白质组内丢掉一个或几个拷贝，种群仍可通过剩余的拷贝完成其生命史和物种延续。当外界环境条件超常优越有利于种群的生长发育时，信息冗余的量增大，使得蛋白质组的集团效应在一定条件下予以强化，在种群遭受外界某种不良环境因子作用时保持稳定而不受影响（李跃强，盛承发，1997）。需要强调的是，酶在生理活动中起着重要作用，通过调节，其化学本质是蛋白质。目前，在生态适应的分子水平的研究中，“生态酶”的概念和功能也令人瞩目；“适应酶”具有更多的多态型，这种多态型无疑与外表形态、性状和生理特性密切相关；同时，新的环境条件下也能够诱导出大量不同的“调节性酶”。近年的研究还发展，许多蛋白由多个从结构到功能都具有相对独立的片段，称为功能域，它可介导蛋白与蛋白质间产生相互作用，因而大大加速了人们对蛋白质功能和生态过程的分子机制的认识。此外，蛋白质作为启动因子可能在环境改变时激活某些基因的表达，从而产生新的蛋白质即环境诱导蛋白来调节生命系统的生理代谢活动，从而进行生态适应。因蛋白质是基因的产物，故基因组有多样性，蛋白质组就有多态性，蛋白质组对环境的生态应用就有多效性。

2．5生物大分子结构与功能的整合作用与种群与环境相互作用的机制

　　蛋白质与核酸等生物大分子是生命的主要体现者，但不是生命本身。核酸和蛋白质是相互依存和彼此制约的，没有核酸就没有蛋白质，没有蛋白质，核酸是没有功能的。生命的本质是这些生物大分子之间，以及它们与环境之间复杂而有序的相互联系和相互作用。目前，人们关于蛋白质和核酸整合作用的知识仍是相当有限的，而这些发生在各种水平上的DNA复制和表达及其诸多调节过程在生命活动中极其重要。只有透彻分析核酸和蛋白质的整合作用，才能深入探讨种群与环境之间相互作用的分子机制。

　　1970年Temin和Baltimore发现DNA和RNA间存在逆转录现象，而且这一现象不断在真核生物中被发现，因而中心法则被修改。现在越来越多的证据表明这种逆转录机制广布于正常细胞的代谢之中。例如：断裂基因（内含子、外显子）、假基因（加工基因）、重叠基因、重复基因（重复序列）等基因现象，进一步证明了蛋白质和核酸之间的整合作用及其与环境之间的相互作用。在一定的环境（包括生长发育、生理需要等内部环境和外界一切环境）条件下，种群某一遗传效应的DNA片段（遗传信息的贮存库）得到表达，产生这一遗传效应的RNA（遗传信息的施工图），RNA转译产生相应的蛋白质，这种蛋白质及其表现出的生理作用、生化功能、形态结构等应用环境条件。在环境条件仍然满足其种群遗传效应的表达时，就会通过影响蛋白质，进一步对RNA进行调控，使其DNA片段得以充分表达，产生大量的这一遗传效应的RNA，在高浓度的RNA条件下，逆转录成cDNA的可能性增大，形成的cDNA通过插入、整合，从而形成这一遗传效应的DNA重复序列，从而更加强了这一遗传效应。种群所处的环境是不断变化的（包括自身内部环境），其变化的影响是由浅入深的，可以表现为形态的、生理的、生化的、转录与复制的。环境影响时间短、强度小，则可能表现为遗传进化。长期促进RNA转录，是在环境条件有利的情况下，它形成RNA的调频表达的这段DNA，再表达且稳定遗传时即为进化。长期抑制RNA转录，是在不利的环境条件下，性状表达的该DNA链区长期得不到利用或转录，从而易被封闭或丢失，形成痕迹性状或完全消失，即为退化。基因重组、染色体加倍等变化，也无不遵守这一规律。种群随着环境环境逐渐地变化而不断改变自己，使自己不断适应逐渐改变的环境。

2．6分子生态学的深入发展依赖分子标记和检测技术的重大突破

　　客观地说，分子生态学还是一门十分年轻的学科，它没有公认的学科创始人和标识性的学术论著，其发展主要通过跟踪精确的分子标记技术和分子检测技术来准确地鉴别生物大分子结构与功能的差异，借此来揭示生物与环境相互作用的分子机制，这是分子生物学最显著的学科特征。

　　分子生态学研究始终依赖和跟踪分子标记技术和分子检测技术。分子标记技术包括限制性片断长度多态（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）、单核苷酸多态（Single nucleotide polymorphisms, SNP）、扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism, AFLP）、随机扩增DNA多态性（Random amplified polymorphism DNA, RAPD）、可变的串连重复多态（Variable number of tandem repeats polymorphism, VNTRP）和PCR技术；分子检测技术包括DNA（或RNA）序列分析、片段分析（长度分析），单链构象多态性（Single strand conformation polymorphism, SSCP）、变性梯度（Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE），温度梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE）、变性高效液相色谱（Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC）。Weber（1989）通过PCR扩增和直接的序列测定发现了一类特殊的VNTR，其串连重复的核心单元仅由2个碱基组成，称为微卫星（Microsatellites），它与等位酶和RFLP一样是很好的共显性标记物。随着基因组测序计划的开展以及更多的蛋白质序列和结构的测定，微卫星可以揭示出更高水平的多态性。

　　分子生态学的结构和功能研究可能基于核酸技术，也可以有基于蛋白质技术，即直接研究基因的表达产物。基于核酸的技术主要有两种：一种是基因表达顺序分析法，即首先分离到细胞的信使RNA（mRNA），也就是正在发挥作用的基因的转录产物，再逆转录成互补DNA（cDNA），经标记和酶切，再用聚合酶链反应主（PCR）复制扩增，通过对这些基因片段的序列分析来研究基因的活动规律。另一种技术是显微排阵法，主要是利用标记cDNA和mRNA的杂交在一种显微体系中进行排列，使其可以在较大规模上来研究基因表达的模式和规律。这两种技术都可以用于检测在不同条件下的基因表达情况。然而，细胞内mRNA的信息还不能代表基因产物最终功能形成蛋白质的信息，mRNA的丰度并不一定与最终表达产物蛋白质有直接关系，更何况许多功能蛋白还有翻译后修饰和加工，包括蛋白质剪接，所以最终还是要用蛋白质研究来补充核酸分析数据。相对于基因组研究的进展速度，蛋白质组的研究显得相对滞后，主要原因是研究手段中多技术问题尚未很好解决。分析全部10万个基因的功能，最直接的是蛋白质组研究。而从这几年中对基因组全序列分析已经完成的一些低等生物蛋白质组的研究看来，目前最现实、最有效的技术是双向凝胶电泳分离纯化蛋白质，结合计算机定量分析图谱进一步用质谱对分离到的蛋白质进行鉴定，并运用现代生物信息学的知识和技术对所得到的天文数字的数据进行处理，对蛋白质组的研究可分为两个阶段：第一阶段，建立一个细胞或一个组织或一个机体在“正常”条件下的蛋白质二维凝胶图谱，或称参考图谱，即所谓“组成蛋白质组”。第二阶段，则要研究在各种条件下的蛋白质组的变化，从中总结出生命活动的规律，可以称为“功能蛋白质组”。

　　目前，分子生态学主要的技术手段是VNTR技术，其次是PCR技术，核酸测序和序列分析技术正在迅速发展，等位酶技术所占的比重较小。虽然基因组测序研究已经取得了突破性进展，但成功破译基因组序列的物种或种群仍寥寥无几，生物与环境相互作用的分子机制研究期待着对每一个物种及种群基因组序列的了解，显然，这还要经历生个较长的发展历程。蛋白质组测序的开展使分子生态学研究又展现出新的曙光，使得人们能够更容易的在微观的、更真实直接的水平上了解生物与环境之间的联系和差异。以基因组序列和蛋白质序列的信息提取与分析和以生物信息的收集、存储、管理、分析和提供为主要内容的生物信息学的迅猛发展，必然使分子生态学的研究进入一个阐明生态现象的分子机制的快速发展期。

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